不同波長光照對周氏嚙小蜂黑視蛋白基因表達的影響

劉新宇，王 靜，潘麗娜，李 敏

（1.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室∕天津市動物多樣性保護與利用重點實驗室，天津 300387；2.漯河市豫中南林業有害生物天敵繁育研究中心，河南 漯河 462300）

多數種類的昆蟲存在趨光行為，這對尋找食物、交配和搜尋產卵場所等行為起到重要作用［1］。了解昆蟲對光的趨向性有助于對昆蟲的研究和管理，對趨光性加以利用，可應用于如標本采集、檢查檢疫、害蟲治理、昆蟲的監測和預報等工作?；谌找鎳谰纳鷳B環境及人類健康問題，利用昆蟲趨光性進行害蟲防治具有重要的優勢，因此國內外學者對昆蟲趨光性機理領域的研究日益增多與深入。

不同昆蟲對特定范圍光譜的趨性反應有正負之分，其對特定波長的光具有敏感性，是因為復眼小眼或單眼內有對特定頻率光波響應的視覺細胞，這些細胞的細胞膜上存在感光的視蛋白［2，3］。其中，黑視蛋白是一種研究較廣泛的視蛋白［4-7］，Provencio等［8］從爪蟾（Xenopus laevis）皮膚黑素細胞和眼中提取分離出具有視蛋白基本結構的物質。在其敏感光波方面，Panda 等［9］測定黑視蛋白對479 nm 波長的光波有最大響應。此外，有文獻記載，人類黑視蛋白最大波長為483 nm、獼猴的為482 nm、小鼠的為481 nm、大鼠的為84 nm［10］。還有研究表明，黑視蛋白的感光功能獨立于視覺系統［11］。黑視蛋白有著調節生物晝夜節律、成像反應的功能［8］，關于黒視蛋白的研究主要集中在脊椎動物中［12-15］，在無脊椎動物中較少涉及。經NCBI 上檢索，在昆蟲中僅有瓜實蠅（Bactrocera cucurbitae）、切葉蟻（Acromyrmexechinatior）、豆莢草盲蝽（Lygus hesperus）、掠猛蟻屬（Harpegnathos）、柑橘木虱（Diaphorina citri）和中華蜜蜂（Apis cerana）等物種的相關序列信息。

美國白蛾（Hyphantria cunea），又名美國燈蛾、秋幕毛蟲，屬鱗翅目燈蛾科白蛾屬，是中國重要的入侵農業害蟲，可危害200 多種林木、果樹、農作物和野生植物，最嗜食桑、白蠟槭，其次為梧桐、李、櫻桃等［16］，已被列入中國首批外來入侵物種。由于化學防治對環境造成的危害嚴重，并且美國白蛾的寄主分布廣泛，美國白蛾的生物防治逐步引起人們的重視，常用周氏嚙小蜂來控制美國白蛾的數量。

周氏嚙小蜂（Chouioia cuneaYang）是美國白蛾蛹期的重要寄生性天敵，體長1.1～1.5 mm，群集內寄生于美國白蛾蛹中，是美國白蛾的主要天敵，對抑制美國白蛾的危害起到重要作用［17］。試驗觀察中證實周氏嚙小蜂對光具有很強的趨性，但其趨光性分子機制未見相關研究報道。

本研究對周氏嚙小蜂的黑視蛋白基因進行了克隆及分析，并研究了經不同波長光照處理后，利用qPCR 技術檢測其表達差異，繼而探究周氏嚙小蜂趨光性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及處理

周氏嚙小蜂為實驗室培養，培養條件：于PQX-350H 型人工氣候箱中，溫度25 ℃，相對濕度60%～80%，光周期L∶D = 14 h∶10 h。接種于柞蠶蛹中，待成蟲羽化后，從蛹中飛出，收集羽化24 h 內的周氏嚙小蜂進行試驗。

1.2 試驗方法

選取試驗光源為紅色光（波長在625～740 nm）、黃色光（565～590 nm）、藍色光（440～490 nm）和白色光4 種顏色的LED 燈，4 個經過DEPC 水處理與高溫蒸氣滅菌處理的透明離心管。南孚電池、導線、電池盒（用于為不同波長光源供電），TES1330A 型照度計（臺灣泰仕電子工業股份有限公司），紗布，脫脂棉，并利用瓦楞紙自制暗室。

以并聯方式連接好LED 燈，用照度計測量LED燈垂直照射6 cm 處的光照度，通過添加LED 燈或在燈上用棉花和紗布使其光照度穩定在50～60 lx。將測完光照度的LED 燈按照顏色分別從暗室頂部插入，插入時可從暗室頂部開出小孔。取羽化24 h 內的周氏嚙小蜂于離心管中，在4 種光波下照射2 h，之后立即浸于RNAlater（Ambion 公司，AM7020）中備用。

1.3 引物設計

根據之前周氏嚙小蜂轉錄組測序結果得到的黑視蛋白Melanopsin基因，由Primer5 和DNAman 軟件設計目的基因Melanopsin實時定量擴增引物。目的片段大小為100～200 bp，其中內參基因為glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GADPH），引物序列見表1，由北京奧維森基因科技有限公司合成。

表1 實時熒光定量PCR 中使用的引物序列

1.4 總RNA 提取

總RNA 的提取參照RNeasyMini Kit 說明書步驟，用RNase 處理總RNA，去除總RNA 中殘存的基因組DNA（均為TRAN公司產品）。超微量紫外分光光度計（NanoDrop 2000）在波長260、280 nm 處測定其濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。

1.5 cDNA 合成

取不同處理總RNA 各5 μL 分別與1 μL 的Random Primer（N9）（0.1 μg∕μL）、10 μL 的2×TS Reaction Mix、1 μL 的TransScript?RT∕RI Enzyme Mix，然后用Rnase-free Water 補足20 μL，將混合體系于恒溫水浴鍋中先于25 ℃孵育10 min，再于42 ℃中孵育30 min，最后在85 ℃加熱5 min 失活TransScript?RT，將cDNA 樣品于-20 ℃保存。

1.6 實時定量PCR相對定量檢測Melanopsin表達

Real-time PCR 反應體系總體積為20 μL，其中3 μL cDNA 樣品（水為空白對照），引物為100 ng∕μL。實時定量PCR 的反應程序為50 ℃預變性2 min，95 ℃變性2 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，共40 個循環。

檢測每個樣品目的基因和內參基因的Ct值，每個樣品設置3 次重復，根據樣品的Ct值就可計算出樣品所含的模板量，比較目的基因Mel和內參基因GADPH的初始模板量，即可得出目的基因的表達量。

1.7 數據分析

采用獨立樣本t檢驗分析4 種顏色的光處理對黑視蛋白基因表達的影響，采用ANOVA 方差分析交配對Mel表達的影響。數據使用統計分析軟件SPSS 16.0 進行處理分析。

2 結果與分析

經過實時定量PCR 試驗，結果如圖1 所示。不同波長的光對周氏嚙小蜂黑視蛋白基因的表達量具有一定影響。白色光對黑視蛋白基因的表達無明顯的促進作用。在單色光中，黃色光激發的表達量最大（9.99），顯著大于其他光處理（P＜0.05），其次為藍色光（6.66），其表達量顯著高于紅色光和白色光；最小的是紅色光（1.18），其表達量低于白色光（2.41），但二者之間差異不顯著。由此可知，周氏嚙小蜂的黑視蛋白基因對黃色光波最敏感。此外，根據白色光和黃色光激發的表達量，在黃色光波段，光強對黑視蛋白基因的激發量有顯著影響。

圖1 4 種波長的光照射周氏嚙小蜂2 h 后黑視蛋白基因表達量

3 小結與討論

已知黑視蛋白在脊椎動物中對波長在481 nm（屬于藍色光范圍）附近的光波最為敏感［10］。本試驗表明，在周氏嚙小蜂中，最能促進黑視蛋白基因表達的是黃色光波（565～590 nm）。此外，相對于特定波長范圍內的光波，復合的白色光波對黑視蛋白并無明顯的促進作用。白色光是具有連續光譜的復合光，在光子層面表現為能量分布符合E=hv（E為能量，h為普朗克常量，v為光的頻率），該公式表明在一定光強度下，單位時間內LED 燈發射有限的特定能量的光子，當光照度在恒定的范圍內，光子的總能量保持不變，當光子的頻率范圍拓寬時（白光），高頻率的光子數量減少，導致頻率處于黃色光范圍內的光子數量減少，進而使得黑視蛋白表達量下降。

結果表明，周氏嚙小蜂的黑視蛋白基因對黃色光波敏感，可能與基因中存在對565～590 nm 波長光敏感的光誘導型啟動子有關。此外，根據白色光和黃色光激發的表達量，在黃色光波段，光強對黑視蛋白基因的激發量有顯著影響。

光誘導型啟動子屬于天然誘導型啟動子，這些啟動子位于環境應答基因的上游。在植物中，光誘導型啟動子較常見，其常有若干個光應答原件，如G-box、Z-Box、AT-rich 序列等，這些元件對光調控的轉錄激活是必須的［18］。本研究結果將有助于了解周氏嚙小蜂的趨光性機理，為更加科學合理地利用周氏嚙小蜂積累相關數據。但關于周氏嚙小蜂體內的黃色光敏感的黑視蛋白基因的光誘導型啟動子的性質還有待進一步研究。