家畜精液冷凍技術研究進展

呂艷麗，劉 剛，蔣桂榮，楊 蓉，王 燕，周 迪

（貴州省種畜禽種質測定中心，貴陽 550000）

中國畜禽遺傳資源豐富，地方優良畜禽品種繁多，如北京番鴨、中山麻鴨、上海水牛、小尾寒羊、赤水竹鄉雞等。這些優良的地方畜禽品種資源對中國畜牧業發展有重要作用。隨著生態環境的改變、新品種的大量引入、雜交技術的廣泛應用、經濟效應的影響等因素，導致部分地方優良品種逐漸雜化、群體數量急劇減少，甚至處于滅絕或瀕臨滅絕的狀態，因此，畜禽遺傳資源的保護迫在眉睫。畜禽遺傳資源保護的方法主要有活體保護（即保種場、保護區）、生物冷凍保存技術（即冷凍配子、細胞、胚胎等）、基因文庫技術、體細胞克隆技術及分子遺傳標記等［1］。精液冷凍保存技術（Semen freezing）是利用液氮（-196 ℃）或干冰（-79 ℃）等作為冷源，將動物的精液通過特殊處理后，在超低溫環境中進行長期保存的一種方法。該技術以其優勢在瀕危物種的資源保護工作中備受青睞，解決了人工授精受時間和空間限制的問題，為畜禽遺傳資源保護提供了有利條件。精液冷凍保存技術在奶牛、豬、羊、馬等家畜遺傳資源保存中取得了進展，并逐漸應用到生產實踐中，是家畜遺傳資源長期保存的有效方法。本研究從精液冷凍技術的發展歷程、細胞冷凍損傷機制、家畜精液的采集、精液品質檢測、稀釋液成分、精液稀釋方法、冷凍及解凍方法等關鍵技術環節，對精液冷凍技術在家畜中的研究進展進行綜述，以期為精液冷凍技術的應用發展提供參考。

1 精液冷凍技術的發展歷程

精液冷凍技術研究已經受到國內外研究者的廣泛關注。1776 年，Lazaro Spallanzani 發現，將人的精液埋藏在雪中一段時間，恢復溫度后仍有少數精子可以存活［2］，這一發現為后來的精液冷凍技術打下了基礎。1949 年，Polge 等［3］發現在牛精液冷凍保存時加入甘油對精子具有保護作用并且通過試驗發現，在家禽精液稀釋液中加入20%的甘油后放置在-80 ℃短暫冷凍保存，解凍后精液能夠恢復活力。這一發現標志著精液冷凍技術的誕生。此后，許多研究者相繼在牛、馬、豬、羊等多種家畜中進行精液冷凍技術的研究，并取得了相應成果。這些研究包括冷凍稀釋液的成分、冷凍保護劑種類及濃度、稀釋方法、冷凍方法、降溫速率及解凍方式等。隨著該技術的發展，其在畜禽種質資源保護中發揮著越來越大的作用。

2 精液冷凍保存機理及損傷機制

精液冷凍技術是利用低溫條件下，精子的新陳代謝減弱，一切生命活動緩慢到幾乎完全停止的狀態，從而達到長期保存精液的目的。同時，冷凍保存的精子，在合適條件下（溫度、時間等）解凍復蘇后，生命活動完全或部分恢復，其質量足以完成正常的人工授精過程，從而解決了人工受精過程中精液受時間、空間等限制的問題。在精液的冷凍過程中，精子會受到不同程度的化學損傷和物理損傷，從冷凍技術發展以來，對細胞冷凍損傷機制的探索沒有停止。很多學者對細胞冷凍機制做了大量研究，并提出了多種假說。20 世紀50 年代科學家Lovelock 等提出電解質失衡假說，1951 年Kreyberg 提出血液循環障礙假說，1965 年Karrow 提出結構水假說，1970年Meryman 提出最小臨界細胞容積假說，1972 年Mazur提出細胞冷凍損傷的兩因素假說等［4］。其中，細胞冷凍損傷的兩因素假說提出以后，得到大多數學者的認同。該假說認為，低溫冷凍過程中造成細胞冷凍損傷，主要是由2 個獨立因素引起的，即溶液濃度的改變和胞內冰晶的形成，從而使得精子受到不同程度的溶液損傷（化學損傷）和胞內冰損傷（物理機械損傷）［5］。

如圖1 所示，在精液冷凍過程中，降溫的速率對細胞損傷程度起決定性作用。當溫度逐漸降低到溶液冰點時，精子外的溶液會形成冰晶（圖1B），此時若降溫速率過慢，胞外水分不斷形成冰晶，導致細胞外液電解質濃度過高，胞外溶液滲透壓增大，胞內水分不斷通過細胞膜流向細胞外，使得精子因嚴重失水發生收縮；隨著胞外冰晶持續不斷形成，細胞外液長期處于高滲狀態引起細胞持續收縮，造成精子蛋白質損傷及細胞膜的不穩定，從而產生“溶液損傷”，即化學損傷（圖1C）。若此時降溫速度過快，會導致細胞內的水分來不及滲出就直接形成冰晶，胞內冰晶會破壞精子的超微結構，產生“胞內冰損傷”，即物理機械損傷（圖1D）。無論是快速降溫引起的胞內冰晶損傷，還是慢速降溫引起的溶液損傷，都能導致精子死亡。因此，為了減少低溫冷凍過程對精子的損傷，保證精子的存活率，需要在溶液損傷和胞內冰損傷之間找到平衡點，使得降溫速率低至能夠防止精子形成胞內冰晶損傷，高到可以將溶液損傷降到最低，即最佳冷凍降溫速率。當降溫速率低于最佳降溫速率時會導致精子遭受溶液損傷，而降溫速率高于最佳降溫速率時細胞內形成胞內冰晶，導致精子遭受物理機械損傷［6］。

圖1 精子冷凍過程中溶液損傷和胞內冰晶損傷形成過程

3 家畜精液冷凍的關鍵技術

3.1 家畜精液的采集

精液的采集是制作家畜冷凍精液的重要步驟，采集精液的質量對制作冷凍精液成功與否具有決定性作用。常用的采精方法主要有手握法、按摩法、假陰道法、電刺激法。不同家畜適宜的精液采集方式也不同。如豬精液的采集，手握法較為常見。此外，采集精液時需嚴格按照技術流程進行規范操作；采集精液前需要做好衛生清潔工作；采精時一般僅保留中段精液，以確保所采集的精液能滿足冷凍保存和受精的質量要求。

精液冷凍前需要進行精液質量鑒定，主要從精液的外觀（一般包括精液顏色、氣味、采精量、質地等）、顯微鏡觀察（精子的活率、密度和形態）等方面進行檢查。對于家畜來說，合格的精液一般為乳白色或淺灰色，略帶腥味，質地均勻無水乳分離現象。不同物種射精量也不相同，一般情況公豬的一次射精量為200～400 mL，奶牛為5～10 mL，水牛為3～6 mL，綿羊為0.8～1.2 mL。合格的豬原精液外觀色澤正常，為乳白色，有一點腥味但無臭味，精液中沒有膿性分泌物及其他臟污，檢測精子密度≥2 億∕mL，活率≥90%，活力≥80%，畸形率≤10%［7］。

3.2 精液冷凍技術

3.2.1 精液稀釋液的成分 精液冷凍稀釋液主要包括冷凍保護劑、緩沖液、添加劑、抗氧化劑及抗生素等［8-10］，如表1 所示。在精液冷凍過程中，由于溫度降低，精子內外會形成不同程度的冰晶并且導致細胞滲透壓改變，從而造成精子產生不同程度的損傷［11］，為了減輕細胞的損傷程度，需要在精液稀釋液里加入冷凍保護劑。冷凍保護劑可以改變細胞的滲透壓，防止細胞長時間的持續嚴重脫水，減輕細胞收縮程度。此外，冷凍保存液可以有效緩解胞內冰晶的形成，從而降低精子在冷凍過程中受到損傷的程度［12］。冷凍保護劑根據化學結構可分為醇類、酰胺類、糖類、蛋白質、無機鹽等，根據作用機制可分為滲透性冷凍保護劑（丙三醇、乙二醇、丙二醇、甲醇等）和非滲透性冷凍保護劑（糖類、卵黃等）。

表1 畜禽冷凍精液稀釋液種類、作用和常用物質

甘油是應用較廣泛的滲透性冷凍保護劑，其可以從細胞外滲透到細胞內，并且與膜脂的極性頭基團形成氫鍵，阻斷水分子自由滲透，降低細胞膜內外溶液濃度差，減少滲透性損傷。此外，甘油黏度增加可以防止溶質共生結晶，從而改變保護劑的機械性能，減少機械損害［13-15］。研究表明，高濃度的甘油會對精子產生毒害作用，從而影響冷凍精子的受胎率［16］。為了減少甘油對精子的毒害作用，尋找最佳的使用濃度，許多學者對不同物種精子稀釋液中甘油適宜濃度進行了研究。劉晉津等［17］研究表明，在豬精液抗凍保護劑中加入4%的甘油，冷凍-解凍后精子活力最佳。宋國欣等［18］的研究表明，在絨山羊精液抗凍保護劑中聯合使用海藻糖和甘油具有較好的冷凍保存效果，當甘油濃度為1%時，精子冷凍保存效果最佳。張鵬等［19］研究發現，在牛冷凍精液稀釋液中添加4%的甘油，精子冷凍效果最好。郝冠英等［20］研究表明，在綿羊精液冷凍稀釋液中使用甘油與二甲基乙酰胺（DMA）協同作用可以提高精子冷凍保存的效果，并且甘油濃度為3%時效果最佳。

糖類是一種很好的非滲透性冷凍保護劑，在稀釋液中同時加入糖類和甘油，可以很好地降低精子受損傷程度，從而達到更好的冷凍保護效果。在實際研究及應用中，通常使用葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇、海藻糖等糖類作為冷凍保護劑。張樹山等［21］研究表明，在豬精液冷凍稀釋液中添加海藻糖的冷凍保護效果顯著優于蔗糖、乳糖。郭志林等［22］研究發現，在稀釋液中加入果糖可以提高烏骨羊精液解凍后精子的運動和存活能力、質膜與頂體的完整性。劉維平等［23］研究了海藻糖對牛精液冷凍保存效果的影響，發現添加海藻糖能提高牛精液冷凍保存后精子存活率，添加0.06 mg∕mL 海藻糖時精子頂體完整率最高。

卵黃在精液冷凍過程中也具有很好的冷凍保護作用，卵黃中的低密度脂蛋白會依附到精子的細胞膜上，形成一種凝膠化狀態的保護膜，保護精子質膜的完整性，避免其受到損傷，從而達到保護精子的作用，不同物種中卵黃的添加量也各不相同。研究表明，在山羊精液稀釋液中加入2.5%的卵黃，精子解凍后，用于人工授精效果較好［24］。在牛的精液稀釋液中添加8%的椰子油與20%的卵黃，可以提高解凍后精子活力［25］。在豬冷凍精液稀釋液中，研究不同濃度卵黃對冷凍后精子質量的影響發現，精液冷凍稀釋液中卵黃的濃度以20%為宜［26］。張桐煒等［27］對遼寧絨山羊冷凍稀釋液的配方研究發現，遼寧絨山羊最適細管冷凍基礎稀釋液E（100 mL）配方為Tris 3.44 g、檸檬酸1.83 g、果糖1.26 g、15%的卵黃、5%的甘油。

此外，精液稀釋液的成分還包括添加劑、抗氧化劑、緩沖液等。研究表明，在豬精液冷凍稀釋液中添加咖啡因、乙酮可可堿、細胞因子、氨基多糖、抗生素等物質，不僅可以提高精子活力，還可以延緩精子衰老［28］。在精液冷凍過程中，由于受低溫環境的影響，精子會產生大量的活性氧（ROS），過量的活性氧會對精子頂體、質膜、蛋白質、線粒體等結構造成損傷，從而影響精子冷凍保存后的功能及活性［29］。為了減少ROS 對精子的損傷，可以在精子稀釋液中加入抗氧化劑，如白藜蘆醇、蝦青素和黃芪多糖等。Zhu 等［30］對豬精液冷凍保存中白藜蘆醇是否通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）保護豬精子免受ROS 脅迫進行研究，結果表明，添加50 μmol∕L 白藜蘆醇可顯著提高豬精液解凍后精子的活力、質膜及頂體的完整性、線粒體活性、谷胱甘肽（GSH）水平及AMPK 的磷酸化水平等。Guo 等［31］研究表明，在豬精液冷凍稀釋液中添加蝦青素（AST）可以抑制精子質膜過氧化，調節質膜脂肪酸的組成，能夠有效提高解凍后精子的質膜及頂體的完整性、精子活力等。Weng 等［32］研究表明，在豬精液稀釋液中添加黃芪多糖可以降低ROS 的濃度，提高精子的抗氧化能力，避免精子受氧化應激反應的影響。

3.2.2 精液的稀釋方法 常用的精液稀釋法有一次稀釋法和二次稀釋法。一次稀釋法是將精液與含有甘油的稀釋液按比例一次性稀釋后直接進行冷凍；二次稀釋法是將精液與稀釋液Ⅰ（不含甘油）等體積混勻（降溫前），隨后緩慢降溫至5 ℃后與等體積的稀釋液Ⅱ（含有甘油）混合，置于5 ℃環境平衡5 min，使溶液中的甘油充分混勻。二次稀釋法可有效減少甘油對精液中精子的毒害作用。

根據精液分裝保存方式的不同，可分為安瓿法、顆粒法、細管法和扁平塑料袋法。顆粒法一般使用一次稀釋法制作，細管法和扁平塑料袋法常選擇二次稀釋法。在實際生產中，使用頻率較高的是細管凍精法，其具有冷卻迅速、密閉無菌、不易污染、操作方便等特點，細管保存法常用的規格有0.25、0.50、5.00 mL。Bwanga 等［33］研究發現，0.25 mL 細管凍后精子活率明顯高于5.00 mL 細管。薛琦［34］通過分析細管類型對豬精液冷凍保存解凍后精子活力的影響發現，-80 ℃條件下，0.25、0.50 mL 細管冷凍效果無明顯的差異，而-196 ℃條件下，0.50 mL 細管冷凍效果明顯優于0.25 mL 細管。

3.2.3 精液的冷凍 精液冷凍方法主要采用的是程序冷凍法和液氮熏蒸法。程序冷凍法主要是通過程序化控制液氮噴入冷凍儀的量來控制降溫的速率。程序冷凍法可以實時監控溫度的變化，通過控制溫度下降的速率，減少降溫速率對精子形成的損傷，但程序冷凍法對儀器設備的要求較高。液氮熏蒸法一般采用泡沫箱或自制的冷凍儀裝液氮，過程簡單、快捷、易操作，對儀器設備的要求較低，但無法控制冷凍過程中溫度下降的速率。吳衍等［35］通過研究對比犬精液的冷凍方法發現，使用程序冷凍法的冷凍效果顯著優于液氮熏蒸法。

3.3 冷凍精液的解凍

冷凍精液的解凍方式一般有干解法和濕解法。干解法是將冷凍的精液放置于設定溫度的水浴鍋中解凍，隨后與預熱的解凍液按一定的比例混勻。細管法凍存的精液一般使用干解法解凍。濕解法是將凍存的精子直接放到預熱的解凍液中解凍，顆粒法凍存的精液一般使用濕解法解凍。

冷凍精液的解凍溫度、時間對解凍后精子的存活率、頂體及質膜的完整性等具有重要影響。精子在解凍時存在1 個溫度危險區，即-25～-5 ℃，為避免精液解凍過程對精子造成損傷，需快速越過溫度危險區，減少在溫度危險區停留的時間［36］。冷凍精液解凍時，可以根據不同的解凍溫度設置不同的時間來提高解凍后精子的活力，延長精子存活時間。郝愛玲等［37］通過使用不同解凍方法解凍豬冷凍精液后發現，50 ℃快速解凍16 s 后，置于30 ℃靜置40 s的解凍方式較38 ℃慢速解凍30 s 的精子活力好，頂體完整率高。鄭筱峰等［36］通過對姜曲海豬不同解凍方法的冷凍效果研究發現，在解凍精液時，直接將冷凍精液從液氮中轉移到37 ℃水浴的解凍效果（精子質量）較置于室溫一定時間后轉移至37 ℃水浴的解凍效果好。凌培鳳［38］研究發現，豬冷凍精液的較佳解凍溫度及時間分別為37℃解凍30 s、65 ℃解凍5 s。王鳳改等［39］通過研究肉牛解凍溫度對精子活力的影響發現，39.5 ℃解凍30 s 精子活力最好。馬玉婷等［40］在牛精子活力的影響試驗中發現，牛冷凍精液解凍的較佳解凍溫度和時間分別為90 ℃解凍3～4 s、80 ℃解凍4～5 s、70 ℃解凍4～6 s 及80 ℃解凍8～9 s。

4 展望

通過不斷的研究與探索，精液冷凍保存技術在國內外都得到了迅速發展。雖然精液冷凍技術正在逐步應用于畜禽的精液保存中，但是仍存在很多問題需要解決，如降低精子在冷凍過程中受損傷的程度、提高精液解凍后精子的活力、頂體及質膜的完整性等。影響精液冷凍質量的因素很多，如冷凍稀釋液的成分、冷凍保存液的選擇、冷凍方法、冷凍下降速率、解凍方式、解凍溫度及時間等，這些因素與精液冷凍保存成功與否有密切聯系。此外，精液冷凍的相關機理、變化規律等尚不清晰，冷凍過程中發生的分子機制及機理還有待進一步研究。

精液冷凍保存技術對于畜禽遺傳資源的保存及利用具有重要意義，通過對冷凍保存關鍵技術的研究，探索適合的冷凍保存液，優化試劑成分和物質濃度，尋找最佳降溫速率，使用恰當的冷凍-解凍方法及程序等，減少精子在冷凍保存中受到的化學和物理損傷，進一步提高精子存活率及解凍后的受精能力，將有助于畜禽精液冷凍技術的建立、完善和標準化，從而加快地方優良種質資源的保存與利用。