補元湯通過HIF-1/NOR-1途徑改善低氧性肺血管重構的機制研究*

宋文龍 李 瑾

（浙江省建德市中西醫結合醫院，浙江建德 311600）

缺氧性肺血管疾病是一類由缺氧引起的，以肺部中小動脈管壁增厚，血管阻力增加為特點，囊括慢性肺動脈高壓、肺源性心臟病、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等在內的疾病統稱，患者可出現諸如呼吸困難、缺氧發紺、杵狀指（趾）、活動耐量下降以及直立性缺氧等慢性呼吸系統典型癥狀體征［1-2］。這一類疾病在疾病早期癥狀多不典型，病情發展亦相對緩慢，診治存在困難，加之其病理改變難以逆轉，逐漸成為世界性難題。隨著國內外研究的不斷深入，主流研究認為機體缺血缺氧、低氧激活后遺傳修飾以及肺血管重構是該病重要病理學基礎［3-5］。與此同時，我們觀察到缺氧環境和香煙煙霧暴露可以促進大鼠肺動脈平滑肌的異常增殖，參與肺血管重構過程，而補元湯能減輕COPD 大鼠氣道炎癥，改善COPD 大鼠氣道及肺血管重塑的程度［6］。大量研究指出肺血管重塑主要與肺動脈平滑肌細胞（PASMC）的過度增生、遷移和程序性細胞死亡受到抑制有關［4］。低氧誘導因子（HIF-1）被廣泛認為是對缺氧（低氧水平）應答的主要調節因子，參與控制機體多種過程（血管生成、代謝、增殖及凋亡）等。孤兒核受體-1（NOR-1）是一種進化上高度保守的轉錄因子，隸屬于配體非依賴型NR4A 核受體家族，作為早期反應基因，被認為可調控人體細胞的基本功能，如炎癥、增殖等生物過程［7-8］。但HIF-1/NOR-1 在缺氧性肺血管重塑（HPVR）中的具體機制仍不清楚。因此，本研究對PASMCs 采用補元湯輔助治療，以期了解該治療方法對低氧狀態下HIF-1/NOR-1 及肺動脈血管重構的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株及實驗動物

大鼠肺動脈平滑肌細胞：杭州赫貝提供。SD 大鼠，10周齡，體質量300～330 g，均購自上海斯萊克實驗動物中心，許可證號：SCXK（滬）2017-0012。合格證號：2017005012875。

1.2 實驗藥物

補元湯：黨參30 g，麩炒白術15 g，生黃芪30 g，陳皮10 g，當歸10 g，鎖陽15 g，山茱萸肉15 g，補骨脂10 g，升麻10 g，北柴胡10 g，炙甘草5 g。飲片均由本院藥劑科提供，根據《中藥藥理研究方法學》計算出人鼠等效劑量為16 g/kg，并由煎藥室制成100%煎劑［9］，經加熱到70 ℃后旋轉蒸發，將藥劑濃縮成每毫升含生藥量4.8 g。

1.3 試劑與儀器

逆轉錄試劑盒：HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR（貨號R222-01）、定量PCR 試劑盒：ChamQ TM SYBR Color Qpcr Master Mix（貨號Q411-02），南京諾唯贊生物提供。RNA 提取試劑盒（離心柱型）：上海捷瑞生物工程，貨號GK3016；低糖DMEM 細胞培養基：索萊寶，貨號31600；胎牛血清FBS，貨號10099141（美國GIBCO 公司）。WB 試劑盒，購自聯科生物；青霉素鈉，貨號69-57-8（大連美侖生物）；硫酸鏈霉素，貨號3810-74-0（大連美侖生物），0.45 μm PVDF 膜，Millipore 公司；脫脂奶粉，伊利；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）、膜蛋白提取細胞裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司；Tris-Hcl/SDS（1.5 mM，pH8.8）、Tris-Hcl/SDS（0.5 mM，pH6.8）購自上海生工生物工程；Tris 堿、SDS、過硫酸銨購自Biosharp 公司。渦旋振蕩儀：QL-861 型，海門市其林貝爾儀器提供。電泳系統，Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD 公司。凝膠成像儀，ChemiDoc XRS+System，Bio-RAD 公司。倒置顯微鏡：南京江南永新光學有限公司，型號XD202；定量PCR 儀，美國BIO-RAD 公司，型號CFX Connect Real-Time System（96）。

1.4 含藥血清制備

依照臨床用藥習慣，分早晚2 次對SD 大鼠進行補元湯灌胃，每次1 mL，連續1 周，結束后休息1 h，采用乙醚麻醉后腹主動脈采血，靜置2 h，離心過濾除菌，水浴0.5 h滅活，-20 ℃保存備用。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 大鼠肺動脈平滑肌細胞培養 采用10%FBS的低糖DMEM 培養基，平滑肌細胞放入37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。取正常培養的處于對數期的大鼠PASMC，用0.25% Typsin 消化，1 000 r/min 離心5 min，計數板下計數，鋪3 塊6 孔板，每板2 孔，每孔均加入3×105個細胞，分為：常氧對照組、常氧含藥組、10%氧氣對照組、10%氧氣含藥組、1%氧氣對照組、1%氧氣含藥組。每組設9 個復孔。放入培養箱中靜置過夜。每孔分別加250 μL 對照血清和含藥血清，并用培養基補充至1 500 μL，繼續培養2 h，將各組細胞在低氧培養箱中于不同氧濃度下（21%，10%，1%）繼續培養48 h后。48 h后收取細胞做檢測。經上述步驟處理后的大鼠動脈平滑肌細胞先經過濃度為3%戊二醛固定，再予10 mg/mL 鋨酸固定，逐級酒精脫水，氧化丙烯浸透，樹脂包埋、切片后在電鏡下觀察并攝像。

1.5.2 CCK8檢測細胞活力 取大鼠PASMC，經0.25%Typsin消化，1 000 r/min離心5 min，計數板下計數，鋪9塊6孔板，每板12孔，每孔均加入2×103個細胞，培養箱中靜置過夜。每孔分別加25 μL 對照血清和含藥血清，并用培養基補充至150 μL，繼續培養2 h，將各組細胞在低氧培養箱中于不同氧濃度下（21%、10%、1%）繼續培養。加藥處理24 h 后，去掉上清，加入10%CCK8工作液，37 ℃避光反應1 h，450 nm、650 nm 處讀取各孔OD 值，最終OD 值為450～650 nm。按下式計算：細胞存活率（%）=實驗組（OD450-OD650）÷CK 組（OD450-OD650）×100%，以CK組為存活率100%。

1.5.3 qPCR 檢測大鼠肺上皮Ⅱ細胞中B 細胞淋巴因子2（Bcl-2）、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細胞抗凋亡蛋白2（cIAP2）、HIF-1、NOR-1、Rb1 mRNA 相對表達量 將樣本從-80 ℃中取出化凍，Trizol 一步法提取細胞中總RNA，分光光度計檢測總RNA 濃度，按反轉錄試劑盒要求逆轉錄成cDNA。取適量CDNA，加入相應引物后PCR 擴增（各組引物序列詳見表1），最終反應體系為20 μL。擴增條件為85 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s（56.8 ℃、64.8 ℃）退火30 s，融化曲線從70 ℃延伸95℃1 min，0.5 ℃/min，電泳后凝膠成像，行掃描定量分析，以各組凈光密度與β-actin 間比值代表半定量值。

表1 引物序列

1.5.4 WB 檢測HIF-1、Cyclin D1、NOR-1、Rb1、Bcl-2及cIAP2 蛋白表達水平 將各組細胞樣品收集到1.5 EP 管中，每管中加入200 μL 蛋白提取試劑（使用前加入PMSF），混勻后4 ℃靜置30 min，超聲1 min后4 ℃離心機、14 000g離心處理10 min。取20 μg 樣品，加入樣品量2倍體積的上樣緩沖液Buffer，再加入上述總體積1/10的β-巰基乙醇，電泳分離蛋白質，濕法轉膜，加入合適濃度一抗溶液，4 ℃下完成轉膜，取出已封閉的PVDF 膜，加入一抗，4 ℃孵育過夜（Bcl-2、Cyclin D1、NOR-1、cIAP2、Rb1、HIF-1 稀釋比為1∶1 000，β-Actin，1∶5 000）。浸于1×TBST 緩沖液中10 min，于搖床上洗滌，該步驟重復3次。加入二抗（Goat anti-Mouse IgG、Goat anti-Rabbit IgG，1∶5 000），于室溫搖床上孵育1 h。洗膜后將PVDF 膜置于保鮮膜上，取適量ECL試劑盒中等體積的A 液和B 液混合，移入凝膠成像分析儀中，曝光顯影。上述實驗重復3 次。時間為48 h，以對照血清為對照。

1.5.5 流式細胞檢測各組細胞凋亡情況 用無EDTA的胰酶消化離心收集細胞，1×PBS 洗滌細胞兩次（1 000 r/min，5 min），用500 μL Binding Buffer 懸浮細胞，在細胞懸浮液中加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，并設置單染管，搖勻后于4 ℃避光下孵育5 min，上機檢測。

1.6 統計學處理

應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間均數比較采用方差分析。若方差齊，則兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 常氧與低氧組大鼠PASMCs電鏡下形態變化

大鼠PASMCs 分別于常氧和低氧下培養，根據CCK-8 所示結果，我們分別對常氧及1%氧濃度下培養72 h后的PASMCs進行攝片。如圖1所示，常氧下條件下，大鼠PASMCs 正常傳代生長，細胞呈梭形或多角形，外形相對圓潤；低氧下環境下（1%氧濃度）PASMCs數量減少，密度下降，細胞變細變長，細胞間隙增寬。

圖1 PASMCs在常氧和低氧條件下細胞形態特征（100倍）

2.2 各組CCK8活力檢測結果比較

見表2。經10%氧濃度處理24 h 后，PASMC 細胞活力較常氧組下降（P＜0.01），隨著培養時間的延長，PASMC 細胞活力逐漸回升，并在48 h 后超過常氧組，72 h后，與常氧組有顯著差異（P＜0.05）；而在1%氧濃度下，PASMC 細胞活力隨著暴露時間的延長，細胞活力較常氧組顯著下降（P＜0.01）；經補元湯含藥血清處理后，各組PASMC細胞活力均較各對照組下降（P＜0.05）。

表2 各組細胞存活率比較（%，±s）

表2 各組細胞存活率比較（%，±s）

注：與常氧組對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與10%氧氣對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與同種條件的對照血清組比較，*P＜0.05。下同。

組 別常氧對照組常氧含藥組10%氧氣對照組10%氧氣含藥組1%氧氣對照組1%氧氣含藥組24 h 100.00±4.72 88.95±11.60 66.78±8.87△△76.65±8.74▲89.88±22.33 84.50±9.81 48 h 100.00±6.50 103.86±7.73 123.00±4.97△83.72±13.96*80.56±9.32△64.48±15.51△△72 h 100.00±4.27 109.91±8.98 123.00±4.97△119.86±5.50 63.50±5.25△△▲▲53.70±6.47△△▲▲

2.3 各組PASMC 細胞Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1 mRNA表達比較

見表3。和常氧對照組相比，隨著氧氣濃度降低，Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1 mRNA 水平升高，NOR-1、Rb1 mRNA 水平降低；與對照血清組相比，含藥血清組在1%氧氣濃度下Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1 mRNA水平降低比較明顯，NOR-1、Rb1、蛋白水平升高比較明顯（均P＜0.05）。

表3 各組Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1 mRNA比較（±s）

表3 各組Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1 mRNA比較（±s）

組別常氧對照組常氧含藥組10%氧氣對照組10%氧氣含藥組1%氧氣對照組1%氧氣含藥組HIF-1 0.98±0.06 0.83±0.07 1.00±0.00 0.67±0.25 1.46±0.13**▲▲1.25±0.10*▲NOR-1 1.51±0.55 0.80±0.29 0.25±0.08*0.56±0.27 0.10±0.03*▲0.43±0.13*Cyclin D1 0.81±0.11 0.92±0.17 1.09±0.34 1.60±0.43*1.26±0.53 0.65±0.08▲Bcl-2 0.35±0.09 0.58±0.15 1.28±0.17**0.51±0.12##1.79±0.35**1.33±0.50*Rb1 1.29±0.29 1.32±0.17 0.85±0.18 0.62±0.22*0.56±0.13*0.67±0.12*cIAP2 0.58±0.37 0.74±0.49 0.49±0.35 0.43±0.27 2.27±1.69 0.61±0.47

2.4 各組PASMC 細胞Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1蛋白表達比較

見圖2、表4。和常氧對照組相比，隨著氧氣濃度降低，Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1 蛋白水平升高，NOR-1、Rb1、蛋白水平降低，且1%氧氣對照組均具有顯著性差異（P＜0.05）；與對照血清組相比，含藥血清組在1%氧氣濃度下Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1 蛋白水平顯著降低，NOR-1、Rb1、蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。

圖2 各組Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1蛋白條帶

圖3 各組細胞凋亡率

表4 各組Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1蛋白灰度值比值比較（±s）

表4 各組Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1蛋白灰度值比值比較（±s）

組別常氧對照組常氧含藥組10%氧氣對照組10%氧氣含藥組1%氧氣對照組1%氧氣含藥組Bcl-2 0.66±0.10 0.61±0.04 0.77±0.03 1.07±0.04##1.37±0.12**▲▲0.97±0.06##Cyclin D1 0.93±0.16 0.90±0.12 1.20±0.16 1.08±0.11 1.57±0.18**1.10±0.14#NOR-1 1.19±0.07 1.29±0.04 0.92±0.08*1.08±0.01#0.81±0.17*1.14±0.06#▲cIAP2 0.67±0.10 0.53±0.06 0.75±0.03 0.70±0.05 1.31±0.09**▲▲1.09±0.00#▲Rb1 0.92±0.16 1.01±0.06 0.74±0.11 0.87±0.11 0.49±0.05**▲▲0.75±0.15#HIF-1 0.32±0.05 0.30±0.01 0.50±0.07*0.40±0.04 0.76±0.06**▲▲0.59±0.05#

2.5 各組PASMC細胞凋亡率比較

流式凋亡測定不同氧氣濃度下補元湯含藥血清對大鼠PASMC 細胞凋亡的影響。結果示常氧對照組細胞凋亡率為（9.43±0.12）%，常氧含藥組為（5.70±0.42）%，10%氧氣對照組為（15.98±1.25）%，10%氧氣含藥組為（12.32±0.61）%，1%氧氣對照組為（28.62±1.54）%，1%氧氣含藥組為（4.06±0.28）%。隨著氧氣含量的下降，細胞凋亡程度增加（P＜0.01）；與同條件對照血清組相比，含藥血清的細胞凋亡程度減弱（P＜0.05）。

3 討 論

低氧可引起肺動脈壓生理性升高，機體發生低氧性肺血管收縮，若低氧持續存在時，則會導致不可逆性的肺血管重構，肺循環阻力逐漸升高，出現不同程度的右心衰竭，甚至導致死亡。這也是低氧性肺動脈高壓（HPH）發病的重要病理學基礎。肺血管重構包括血管內皮細胞的損傷、平滑肌細胞的增殖以及外膜纖維組織的增多等多種解剖性改變，其中肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）的增殖和凋亡失衡是導致肺血管重塑的主要原因［5，10］。調節低氧導致的PASMCs 增殖和凋亡機制，對低氧性肺血管重構治療干預非常重要。在該階段中，許多細胞因子和生長因子觸發了調節細胞周期起始的復雜而又交錯的信號轉導途徑。但是，控制這些過程的基因尚未明確。亦有多項研究運用基因表達分析技術，使此機制中新的轉錄因子不斷得到確認，其間就有HIF-1、核受體NR4A 亞家族（NR4A3 為主，即NOR-1，屬于孤兒NR 類固醇/甲狀腺受體超家族，是早期反應基因）及多種細胞周期蛋白。在HPVR 發生、炎癥反應的復雜蛋白網絡中，是潛在的相關參與者。

本病可由多種肺系疾病反復發作，遷延而來。中醫學根據其臨床表現及疾病演變過程的認識，可歸屬于“肺脹”“短氣”“喘促”的范疇［11-13］。該類患者大多體虛病久，損傷正氣，臟氣虛損，血行不暢，故痰凝血瘀，阻滯經絡，主要責之于肺、心、腎，涉及肝脾，痰濁、血瘀、水飲為標，氣虛為主。又因肺主氣、朝百脈，故將氣虛血瘀認為是低氧性肺血管重構中醫發病基礎，這也同時與HPVR時肺的微循環病理改變相對應。

基于對HPVR 中醫病機的認識，我們在國醫大師洪廣祥補元湯［14］的基礎上進行加減，取得一定臨床療效，并通過前期動物實驗發現長期的香煙煙霧及低氧環境暴露可以促進肺動脈平滑肌的異常增殖，參與肺血管重構，而補元湯能減輕大鼠肺部充血和炎癥細胞浸潤，改善COPD 大鼠氣道及肺血管重塑的程度。為了深入研究補元湯對低氧所致肺動脈重構的保護作用及機制，我們將大鼠肺動脈平滑肌細胞置于不同氧濃度下培養，模擬PASMC 所受低氧環境，鏡下大鼠PASMCs 在低氧環境下，數量變少、細胞間隙變大，細胞呈現細長型改變。

有研究［15］將肺動脈平滑肌細胞暴露于缺氧環境下，發現與常氧組相比，缺氧條件下，肺動脈平滑肌細胞凋亡指數并無明顯差異，指出缺氧性肺血管改變與肺動脈平滑肌細胞凋亡指數無相關性，認為肺動脈平滑肌細胞在增殖過程中或不伴有凋亡水平的明顯改變。本實驗結果發現，當置于中度缺氧環境下（10%氧濃度），PASMC 細胞Bcl-2、cIAP2 上升，凋亡率較常氧組上升，隨著培養時間延長，HIF-1 表達上升，信號進入到細胞核內，使NOR-1 水平下調，Cyclin D1 上升，通過結合并激活G1 時期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，G1 期周期抑制蛋白（Rb1）被磷酸化，推動細胞周期由G1 時期進入到S 時期，細胞增殖活力增加，可在一定程度上平衡甚至超過凋亡水平，從而促進血管新生，造成肺動脈的新生和重塑。當氧濃度下降至1%后，隨著暴露時間的增加，PASMC 細胞活力較常氧及中度低氧環境明顯下降，表明長期暴露于過度缺氧環境可使PASMC 細胞活力明顯下降，凋亡率亦上升，導致肺血管的萎縮、閉塞。經補元湯含藥血清干預后，HIF-1、Cyclin D1 表達水平下調，NOR-1、Rb1 表達上調，使細胞周期停滯于G1 期，而Bcl-2、cIAP2 表達下調后，PASMC 細胞活力較常氧下降，但凋亡亦處于較低水平，這有可能延緩肺動脈的重構，維持肺部血管功能［16-20］。

綜上所述，本研究通過建立PASMC 低氧模型驗證了補元湯抑制HIF-1、Cyclin D1 表達，上調NOR-1、Rb1，抑制Bcl-2 及cIAP2 表達水平，降低PASMC 細胞增殖活力，并使其凋亡亦處于較低水平，從而發揮對HPVR 的治療作用。由于HPVR 發病因素復雜，病情發展過程受眾多因素調控，補元湯對于HPVR 是否有其他作用機制尚有待深入研究。