LOXL1-AS1對OGD誘導的人腦微血管內皮細胞損傷的影響

徐 楓， 黎村豐， 朱觀祥

卒中仍然是全球第二大死亡原因，也是導致患者長期殘疾的第一大原因［1］。卒中主要分為兩種類型：缺血性卒中和出血性卒中。幾乎86%的卒中是由腦缺血引起的，這是由于血液從血塊流向大腦的過程中斷，導致大腦缺氧和營養不足，最終導致原發性腦損傷［2］。缺血性卒中是一個復雜的病理過程，其機制尚不清楚。非編碼RNA，包括長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA/miR），通過不同的機制調節基因表達和功能［3，4］。lncRNA 被報道作為miRNA 充當競爭性內源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），影響卒中過程［5］。例如lncRNA SNHG14 通過調節miR-199b/水通道蛋白4 軸促進缺血性腦損傷［6］，lncRNA XIST 的消耗通過miR-362/Rho 相關卷曲螺旋形成蛋白激酶2軸減弱腦缺血/再灌注中的神經損傷和炎癥反應［7］。lncRNA LOXL1 反義RNA 1（antisense RNA 1，LOXL1-AS1）位于人類染色體15q24.1，由10 781 個核苷酸和5 個外顯子組成［8］。LOXL1-AS1 通過調節miR-590-5p 調節的Kruppel 樣鋅指轉錄因子6/血管內皮生長因子信號通路，促進動脈粥樣硬化進展中的血管生成［8］，并通過靶向miR-423-5p/賴氨酸特異性去甲基化酶5C 軸促進骨關節炎進展［9］。然而，LOXL1-AS1 是否在缺血性卒中中起作用仍不清楚。本研究通過HBMEC 的氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）來模擬缺血性卒中模型，旨在探索LOXL1-AS1 在缺血性卒中中的生物學功能并揭示其相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦微血管內皮細胞（human brain microvascular endothelial cells，HBMEC）及其培養基購于上海中喬新舟生物科技有限公司；細胞計數試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）、RIPA 裂解液、白細胞介素（interleukin，IL-6）酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL-1β ELISA 試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） ELISA 試劑盒、膜聯蛋白V（annexinV）-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒購于上海Beyotime 公司；si-NC、si-LOXL1-AS1、miRNC、miR-761 mimic、anti-miR-NC、miR-761 Inhibitor購于廣州RiboBio 公司；兔抗B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）抗體、兔抗Bcl-2相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體購于美國Abcam公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 購于美國Thermo 公司；SYBR Green PCR Master 購于上海Toyobo 公司；pmirGLO 質粒、Dual-Glo熒光素酶檢測試劑盒購于美國Promega公司。

1.2 細胞培養與OGD 損傷 HBMEC 在包含5%胎牛血清、1%內皮細胞生長因子、1%青霉素/鏈霉素的內皮細胞培養基中，在37 ℃、5% CO2氣氛中生長。OGD損傷時，將細胞培養基替換為無糖培養基，并在94% N2、5% CO2和1% O2培養箱中保持。4 h 后將培養液替換為含糖培養基，并在正常培養箱中保持2 h［10］。

1.3 實驗分組 HBMEC 分為對照組（正常培養）、OGD 組（OGD 損傷）、OGD+si-NC 組（轉染si-NC）、OGD+si-LOXL1-AS1 組（轉染si-LOXL1-AS1）、OGD+miR-NC 組（轉染miR-NC）、OGD+miR-761 組（轉染miR-761 mimic）、OGD+si-LOXL1-AS1+陰性對照組（轉染si-LOXL1-AS1 與anti-miR-NC）、OGD+si-LOXL1-AS1+miR-761 抑制劑組（轉染si-LOXL1-AS1與miR-761 Inhibitor）。轉染時，按照制造商Invitrogen 的操作指示，使用Lipofectamine 2000 試劑在HBMEC 中轉染si-NC、si-LOXL1-AS1、miR-NC、miR-761 mimic、anti-miR-NC、miR-761 inhibitor，轉染48 h后，進行OGD損傷。實驗重復3次。

1.4 RT-qPCR 檢測LOXL1-AS1 和miR-761 表達HBMEC 處理結束后，用TRIzol 裂解液在冰上裂解。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的操作流程進行逆轉錄反應，將總RNA 轉化為cDNA。按照SYBR Green PCR Master 的操作流程進行PCR 反應。U6 作為miR-761 的內源對照，GAPDH作為LOXL1-AS1的內源對照。2-ΔΔCt值表示基因的相對表達。LOXL1-AS1正向引物5'-AATTGCCCTCTTGGGC TTAT-3'，反向引物5'-GTCTCACCTTCCCATTCCAA-3'；GAPDH 正向引物5' -CATGAGAAGTATGACAACAG CCT-3'，反向引物5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAG T-3'；miR-761正向引物5'-ACAGGCAGGCACAGAC-3'，反向引物5'-GAGCAGGCTGGAGAA-3'；U6 正向引物5'-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 CCK-8法檢測細胞存活率 將每組HBMEC接種于96 孔板（5×103個細胞/孔），培養48 h。除去之前的培養基，加入CCK-8 和培養基混合物（CCK-8與培養基的比例為1∶10）。在正常培養箱中培養1 h后，通過酶標儀測定培養板在450 nm 處的吸光度OD 值，以實驗組與對照組OD 百分比為細胞存活率（%）。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 將每組HBMEC（1×105）懸浮在結合緩沖液中，按照annexinV-FITC/PI 試劑盒的操作流程，加入5 μl annexinV-FITC 和5 μl PI 試劑，避光反應15 min。應用BD FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7 Western blotting 檢測Bax、Bcl-2 蛋白表達每組HBMEC處理完成后，使用RIPA裂解液在冰上裂解。細胞完全裂解30 min，然后在4 ℃離心機中以14 000 r/min離心15 min。共取50 μg總蛋白，用SDSPAGE 在100 V 下電泳2 h。分離的蛋白質電轉移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉密封膜1 h。然后與Bax 抗體（1∶1 500）、Bcl-2 抗體（1∶1 500）、GAPDH 抗體（1∶2 000）在4 ℃下孵育過夜，與辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗（1∶10 000）一起孵育（室溫，1 h）。使用Pierce ECL 蛋白質印跡底物試劑進行X 射線顯影，并通過Image J分析Bax、Bcl-2蛋白的灰度值。

1.8 ELISA 檢測炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平 收集HBMEC 上清液，按照IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA 試劑盒的操作流程，進行測定，用酶標儀記錄450 nm 處的OD 值，根據標準曲線計算IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.9 雙熒光素酶報告實驗檢測LOXL1-AS1和miR-761 的互補結合 將LOXL1-AS1 的序列擴增并轉移至pmirGLO 質粒下游的熒光素酶基因，獲得WT-LOXL1-AS1。同時根據starbase 軟件預測的LOXL1-AS1 和miR-761 結合位點，獲得含有突變靶點的LOXL1-AS1 片段MUT-LOXL1-AS1。使用Lipofectamine 2000 試劑將WT-LOXL1-AS1、MUTLOXL1-AS1 和miR-761 mimic、miR-NC 共轉染到HBMEC 中。轉染48 h，通過Dual-Glo 熒光素酶檢測試劑盒評估相對熒光素酶活性。

2 結 果

2.1 抑制LOXL1-AS1 對OGD 誘導的HBMEC 損傷的影響 與對照組相比，OGD 組HBMEC 的LOXL1-AS1 表達量增加（見圖1A），存活率減少（見圖1B），凋亡率增加（見圖2A 和圖1C），Bax表達量增加，Bcl-2表達量減少（見圖2B和圖1D，均P＜0.05）。抑制LOXL1-AS1 后，與OGD 組或OGD+si-NC 組相比，OGD+si-LOXL1-AS1 組HBMEC的LOXL1-AS1 表達量減少（見圖1A），存活率增加（見圖1B），凋亡率降低（見圖2A 和圖1C），Bax 表達量減少，Bcl-2 表達量增加（見圖2B 和圖1D，均P＜0.05）。

圖1 抑制LOXL1-AS1對OGD誘導的HBMEC損傷的檢測（n=3，±s）

圖2 抑制LOXL1-AS1對OGD誘導的人腦微血管內皮細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

2.2 抑制LOXL1-AS1 能降低OGD 誘導的HBMEC中炎性因子的水平 如圖3所示，與對照組相比，OGD組HBMEC的炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高（均P＜0.05）。抑制LOXL1-AS1后，與OGD組或OGD+si-NC 組相比，OGD+si-LOXL1-AS1 組HBMEC的IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低（均P＜0.05）。

圖3 抑制LOXL1-AS1對OGD誘導的HBMEC中炎性因子的檢測（n=3，±s）

2.3 LOXL1-AS1 靶向調控miR-761 Starbase 軟件預測的LOXL1-AS1 和miR-761 的互補序列見圖4。miR-761組WT-LOXL1-AS1熒光素酶活性比miR-NC組減少約52.08%（P＜0.05），而MUT-LOXL1-AS1 熒光素酶活性與miR-NC 組無顯著差異（P=0.511）（見圖5）。轉染si-LOXL1-AS1 的HBMEC 中miR-761 表達量比轉染si-NC增加約1.89倍（P＜0.05）（見圖6）。

圖4 LOXL1-AS1和miR-761的互補序列

圖5 LOXL1-AS1雙熒光素酶報告實驗（n=3，±s）

圖6 LOXL1-AS1調控miR-761（±s，n=3）

2.4 miR-761 對OGD 誘導的HBMEC 損傷炎性因子的影響 過表達miR-761 后，OGD+miR-761 組HBMEC 的miR-761 表達量比OGD+miR-NC 組增加（見圖7A），存活率比OGD+miR-NC組增加（見圖7B），凋亡率比OGD+miR-NC 組減少（見圖8A 和圖7C），Bax 表達量比OGD+miR-NC 組減少，Bcl-2 表達量比OGD+miR-NC 組增加（見圖8B 和圖7D），并且IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平均比OGD+miR-NC 組降低（見圖7E，均P＜0.05）。

圖7 miR-761對OGD誘導的HBMEC損傷炎性因子的檢測（±s，n=3）

圖8 miR-761對OGD誘導的人腦微血管內皮細胞凋亡及凋亡蛋白表達的影響

2.5 抑制miR-761 對抑制LOXL1-AS1 處理的OGD 誘導的HBMEC 損傷炎性因子的影響 抑制miR-761 和抑制LOXL1-AS1 后，OGD+si-LOXL1-AS1+miR-761 抑制劑組HBMEC 的miR-761 表達量低于OGD+si-LOXL1-AS1+陰性對照組（見圖9A），存活率低OGD+于si-LOXL1-AS1+陰性對照組（見圖9B），凋亡率高于si-LOXL1-AS1+陰性對照組（見圖10A 和圖9C），Bax 表達量高于OGD+si-LOXL1-AS1+陰性對照組，Bcl-2 表達量少于OGD+si-LOXL1-AS1+陰性對照組（見圖10B 和圖9D），并且IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平均高于OGD+si-LOXL1-AS1+陰性對照組（見圖9E，均P＜0.05）。

圖9 抑制miR-761對抑制LOXL1-AS1處理的OGD誘導的HBMEC損傷炎性因子的檢測（±s，n=3）

圖10 抑制miR-761對抑制LOXL1-AS1處理的OGD誘導的人腦微血管內皮細胞凋亡及凋亡蛋白表達的影響。

3 討 論

缺血性腦卒中是最常見的腦血管疾病類型，是多種因素引起的腦血管循環障礙，發病機制復雜［11］。目前，缺血性腦卒中的分子機制尚不清楚，缺乏早期診斷標志物。HBMEC 位于血液和腦實質之間，對正常的神經功能至關重要，并負責傳輸必需的營養物質和去除潛在的有害毒素［12］。缺血性腦卒中導致腦微血管內皮細胞死亡，并加重神經損傷，保護腦微血管內皮細胞免受缺血性損傷可能對改善腦卒中預后具有重要意義［13］。大量研究表明，腦組織中的炎癥反應發生在多種腦部急性病變中，包括缺血性卒中。缺血性卒中后的腦損傷導致壞死和細胞凋亡，這些會驅動由細胞因子釋放控制的炎癥反應［14，15］。因此本研究利用OGD 處理HBMEC，發現OGD 使HBMEC存活降低、凋亡增加，還提升細胞炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平，與前人研究［10，16］吻合。

研究發現，LOXL1-AS1 在胰腺癌［17］、肺腺癌［18］、食管癌［19］、膠質瘤［20］等多種腫瘤中表達上調，促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。最近的研究還證明LOXL1-AS1 在非腫瘤疾病中具有重要作用。例如，LOXL1-AS1在絕經后骨質疏松癥患者外周血中異常高表達，它抑制人骨髓間充質干細胞的成骨分化但促進脂肪細胞分化［21］。LOXL1-AS1在冠心病患者中高表達，LOXL1-AS1 與miR-16-5p 結合來下調miR-16-5p的表達，從而增強氧化低密度脂蛋白誘導的人冠狀動脈內皮細胞焦亡［22］。敲低LOXL1-AS1 對增殖和遷移產生抑制作用，而加速血管平滑肌細胞和人臍靜脈內皮細胞的凋亡［23］。此外，在骨關節炎軟骨組織中，LOXL1-AS1 上調，沉默LOXL1-AS1 會阻礙軟骨細胞的增殖和炎癥（IL-6、IL-8 表達）［9］。本研究發現，與對照組相比，OGD 處理的HBMEC 顯示出增加的LOXL1-AS1 水平，提示LOXL1-AS1 可能在OGD 介導的HBMEC 炎癥和凋亡中發揮潛在作用。抑制LOXL1-AS1 可增加OGD 誘導的HBMEC 存活，并減輕凋亡和炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平，表明抑制LOXL1-AS1 可以促進細胞存活、減輕凋亡并減弱炎性因子水平，從而改善OGD 誘導的HBMEC損傷。

本研究進一步考察了LOXL1-AS1發揮作用的機制。前人已發現LOXL1-AS1 可充當海綿miRNA 的ceRNA，例如miR-28-5p［24］、miR-708-5p［25］、miR-21［26］。本研究發現，LOXL1-AS1 直接與HBMEC 中的miR-761 結合。miR-761 在急性心肌梗死和缺氧/復氧誘導的HL-1 細胞中下調，miR-761 過表達減輕了缺氧/復氧誘導的HL-1細胞損傷［27］。miR-761保護心肌細胞免受過氧化氫和缺血/再灌注誘導的細胞凋亡和心肌梗死的影響［28］。miR-761 在動脈粥樣硬化中以自噬依賴性方式抑制泡沫細胞形成并減少致動脈粥樣硬化炎癥細胞因子IL-1β和IL-18的產生［29］。然而尚未報道miR-761 與缺血性卒中之間的關聯。本研究證明，過表達miR-761促進OGD處理的HBMEC的存活，抑制細胞凋亡和炎性因子水平。表明miR-761對缺血性卒中的潛在保護效果。此外，抑制miR-761可以逆轉抑制LOXL1-AS1對OGD 誘導的HBMEC 存活、凋亡和炎性因子的影響，表明抑制miR-761 逆轉了抑制LOXL1-AS1 的保護作用。總之，這些數據證明LOXL1-AS1 通過在OGD 處理的HBMEC 中靶向miR-761，調節細胞存活、凋亡和炎性因子水平。

綜上所述，本研究發現抑制LOXL1-AS1 可增強OGD 誘導的HBMEC 存活，并抑制凋亡和炎性因子水平，保護細胞損傷，其機制可能與靶向上調miR-761 表達有關。這有助于更好的理解LOXL1-AS1 和miR-761在缺血性卒中中的作用，二者可能是治療卒中的候選靶點。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：徐楓負責設計論文框架、起草論文；黎村豐負責實驗操作、研究過程的實施；朱觀祥負責數據收集、統計學分析、繪制圖表；徐楓負責論文修改、擬定寫作思路、指導撰寫文章并最后定稿。