船舶壓載水中外來(lái)入侵魚(yú)類的快速檢測(cè)技術(shù)

劉璐 陳治 李揚(yáng) 樊鑫

摘要：為消除壓載水中外來(lái)入侵魚(yú)類對(duì)生態(tài)環(huán)境的潛在威脅，解決傳統(tǒng)的入侵物種檢測(cè)方法存在的不足和局限性，采用傳統(tǒng)調(diào)查方法并結(jié)合環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)對(duì)壓載水中大量樣本的物種鑒定及目標(biāo)物種進(jìn)行信息獲取，構(gòu)建外來(lái)魚(yú)種數(shù)據(jù)庫(kù)，并進(jìn)行定性檢測(cè)及定量評(píng)估，探索建立適合我國(guó)國(guó)情的監(jiān)測(cè)理論和方法，綜合分析評(píng)估魚(yú)類潛在入侵風(fēng)險(xiǎn)，為我國(guó)眾多港口進(jìn)行壓載水處理和管控提供理論依據(jù)，并最終為降低魚(yú)類入侵風(fēng)險(xiǎn)甚至達(dá)到零風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：船舶壓載水；入侵魚(yú)類；快速檢測(cè)；環(huán)境DNA

中圖分類號(hào)：U691+.6;R185.3+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1672-0032（2023）01-0110-09

引用格式： 劉璐，陳治，李揚(yáng)，等.船舶壓載水中外來(lái)入侵魚(yú)類的快速檢測(cè)技術(shù)［J］.山東交通學(xué)院學(xué)報(bào)，2023，31（1）：110-118.

LIU Lu， CHEN Zhi， LI Yang，et al.Fast detection technology for alien invasive fish in ship ballast water［J］.Journal of Shandong Jiaotong University，2023，31（1）：110-118.

0 引言

生物入侵、環(huán)境污染、資源過(guò)度開(kāi)發(fā)和氣候變化帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題已對(duì)全球生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成巨大威脅^［1］。近年來(lái)，以人類為傳播媒介的生物入侵事件在全球范圍愈演愈烈。密集的航運(yùn)業(yè)、水產(chǎn)品和水生寵物貿(mào)易及水產(chǎn)養(yǎng)殖等導(dǎo)致外來(lái)水生生物快速傳播，進(jìn)而引發(fā)生物入侵^［2］。每年通過(guò)船舶貨運(yùn)進(jìn)入我國(guó)的壓載水超過(guò)3.5億t，且還在以年均5%左右的速度遞增^［3］。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，為保證航行的安全性和穩(wěn)定性，一條普通的商業(yè)散貨船在單次航程中攜載的壓載水約3萬(wàn)t，船舶壓載水每天攜帶的海洋生物多達(dá)7000種。大量的浮游植物、浮游動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲(chóng)、魚(yú)卵和仔稚魚(yú)及成魚(yú)被壓載水從原有海域帶到新的海域。船舶壓載水已成為無(wú)意間引入外來(lái)水生生物的最主要途徑^［4］。外來(lái)物種從被引入到成為入侵物種一般需要經(jīng)過(guò)3個(gè)階段：到達(dá)→建群→擴(kuò)散，最終達(dá)到某種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)^［5］，而且一旦入侵成功，極易造成生態(tài)失衡或疾病流行（瘧疾、乙腦、霍亂、登革熱等）^［6］。因此，對(duì)壓載水實(shí)施有效處理和管控已成為港口船舶管理的必要措施和關(guān)鍵步驟。很多國(guó)家都采用多種檢測(cè)方法和監(jiān)測(cè)手段，研究和監(jiān)測(cè)壓載水引入的魚(yú)類。

遠(yuǎn)洋運(yùn)輸在全球?qū)ν赓Q(mào)易貨物運(yùn)輸中發(fā)揮著不可替代的主導(dǎo)作用。2020年我國(guó)港口完成貨物吞吐量145.5億t，包括沿海港口94.8億t和內(nèi)河港口50.7億t，位居世界第一，同比增長(zhǎng)4.3%。內(nèi)河等級(jí)航道里程6.73萬(wàn)km。港口規(guī)模不斷擴(kuò)大，貨物吞吐量超過(guò)2億t的港口達(dá)24個(gè)。中國(guó)出入境船舶壓載水輸入和輸出總量巨大，基本呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。壓載水的輸入量從2015年的約2.8億t增至2020年的約3.6億t，增幅近50%^［7］。通過(guò)壓載水傳播到我國(guó)海域的海洋入侵生物的種類和數(shù)量越來(lái)越多^［8-9］，給我國(guó)海洋環(huán)境保護(hù)帶來(lái)了前所未有的挑戰(zhàn)，對(duì)我國(guó)近岸養(yǎng)殖業(yè)和人民生命財(cái)產(chǎn)安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

因此，需重點(diǎn)關(guān)注被壓載水引入到我國(guó)海域的外來(lái)生物有哪些？它們是否有成為入侵物種的潛在風(fēng)險(xiǎn)？通過(guò)完善壓載水潛在入侵生物檔案庫(kù)并構(gòu)建早期監(jiān)測(cè)預(yù)警技術(shù)體系和平臺(tái)，對(duì)壓載水引入中國(guó)海域的外來(lái)生物數(shù)量、分布及其對(duì)中國(guó)境內(nèi)其他生物和環(huán)境造成的影響實(shí)行有效的跟蹤監(jiān)測(cè)，成為我國(guó)港口遠(yuǎn)洋船舶管理和海洋生態(tài)環(huán)境保護(hù)的當(dāng)務(wù)之急，這也是防止壓載水生物入侵的最直接、最有效的方式。

1 船舶壓載水防治生物入侵現(xiàn)狀

壓載水置換是防控外來(lái)生物入侵的常規(guī)操作^［10］，是指將船舶在離港時(shí)在近岸海域所加的壓載水在航行過(guò)程中更換為遠(yuǎn)洋海水，其中可能引入的遠(yuǎn)洋海洋生物一般難以在近岸海洋環(huán)境生存，可避免將其他港口的近岸海水帶入目的港而導(dǎo)致生物入侵。我國(guó)明確要求船舶必須安裝壓載水處理系統(tǒng)進(jìn)行壓載水置換，且要求在離岸超過(guò)321.9 m或水深大于2000 m的遠(yuǎn)洋中進(jìn)行^［5］。但載質(zhì)量超過(guò)4萬(wàn)t的船舶在大洋中更換壓載水存在一定風(fēng)險(xiǎn)，影響航行安全^［11］。壓載水置換對(duì)于距離較短的國(guó)際航運(yùn)線路也較困難，置換水域的離岸距離可能無(wú)法滿足國(guó)際海事組織（International Maritime Organization，IMO）的要求^［12-13］。

在航行過(guò)程中也可通過(guò)壓載水處理系統(tǒng)對(duì)壓載水進(jìn)行生物殺滅處理。傳統(tǒng)的處理手段有機(jī)械處理法、物理處理法和化學(xué)處理法等^［3］。機(jī)械處理法包括過(guò)濾法、旋流分離法，物理處理法包括加熱法、紫外線照射法，化學(xué)處理法包括電解法、臭氧法和羥基自由基法等，但實(shí)際應(yīng)用時(shí)均存在一定局限性，且不能殺滅壓載水中的所有生物。目前還有部分國(guó)家沒(méi)有施行壓載水處理系統(tǒng)的裝載要求，壓載水不但沒(méi)有在遠(yuǎn)洋海域中置換，而且沒(méi)有進(jìn)行生物殺滅處理，給海洋生物入侵埋下極大隱患，對(duì)近海生態(tài)環(huán)境保護(hù)造成嚴(yán)重威脅。

船舶是否安裝了壓載水處理系統(tǒng)，是采用壓載水置換還是生物殺滅處理，均不能保證壓載水排放的絕對(duì)安全性。對(duì)壓載水引發(fā)的生物入侵應(yīng)以防為主，防治結(jié)合。

2 船舶壓載水中魚(yú)類入侵的潛在風(fēng)險(xiǎn)

我國(guó)壓載水的入侵生物監(jiān)測(cè)對(duì)象大多為微生物、浮游植物和小型無(wú)脊椎動(dòng)物等^{［9，14-16］}，往往忽略魚(yú)類等較大體型生物，很多學(xué)者認(rèn)為壓載水并不是外來(lái)魚(yú)種入侵的主要途徑，相關(guān)研究也沒(méi)有引起足夠重視。在壓載水置換或排放時(shí)通常采用防護(hù)柵欄等設(shè)施粗濾壓載水，但不能阻擋原生生物、硅藻、真核生物幼體及橈足類等出入壓載艙，在航運(yùn)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)防護(hù)柵欄和壓載艙的泵葉被腐蝕甚至缺失等情況，這就為海洋魚(yú)類（幼魚(yú)、成魚(yú)）等被泵入壓載艙創(chuàng)造了機(jī)會(huì)^［17］。我國(guó)于2018年底正式加入《國(guó)際船舶壓載水及沉積物控制與管理公約》，并于2019年正式履約，對(duì)壓載水引入外來(lái)入侵生物的監(jiān)測(cè)和管控仍處在經(jīng)驗(yàn)摸索期。國(guó)外在壓載水魚(yú)類入侵方面的調(diào)查研究相對(duì)較早，已經(jīng)有蝦虎魚(yú)（Neogobius melanostomus）、鲇（Blenniidae）、刺魚(yú)（Gasterosteus aculeatus）、鯡（Clupeidae）、鰈（Pleuronectidae）、梭魚(yú)（Liza ramada）、獅子魚(yú)（Pterois volitans/miles complex）、褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）等被壓載水引入和入侵的魚(yú)類記錄，其中，蝦虎魚(yú)和鲇為最常見(jiàn)種類，大多數(shù)魚(yú)類曾被多次引入^［17-20］。穴居、底棲、耐缺氧和低溫、卵小、耐鹽幅寬或具有發(fā)達(dá)側(cè)線系統(tǒng)的魚(yú)類能夠更好地適應(yīng)壓載水黑暗、缺氧和不平穩(wěn)的環(huán)境。當(dāng)魚(yú)類隨著壓載水被排放至近岸港口時(shí)，礁石、洞穴等為這些魚(yú)類提供了過(guò)渡環(huán)境。大多數(shù)魚(yú)類因?yàn)椴荒苓m應(yīng)當(dāng)?shù)氐酿D料、水文等條件而無(wú)法繼續(xù)生存，只有極少數(shù)魚(yú)類能夠存活，經(jīng)過(guò)到達(dá)、建群和擴(kuò)散3個(gè)階段成為外來(lái)入侵物種。

魚(yú)類一旦入侵成功，比其他入侵水生生物種類的活動(dòng)能力更強(qiáng)，活動(dòng)范圍更廣，生長(zhǎng)更快，壽命更長(zhǎng)，往往更難管控和治理，最終對(duì)當(dāng)?shù)睾Ｑ蟓h(huán)境、海洋生物群落甚至漁業(yè)經(jīng)濟(jì)造成破壞，代價(jià)可能是海洋生物多樣性減少或本土魚(yú)類滅絕，海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)，給漁業(yè)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失，本國(guó)需要支付高額的防治費(fèi)用^［21］。通過(guò)其他途徑，如觀賞魚(yú)引入、生物防控和人工養(yǎng)殖等入侵我國(guó)的非本土魚(yú)類已對(duì)我國(guó)水域造成嚴(yán)重影響，如食蚊魚(yú)、羅非魚(yú)等^［22-25］。1985年，印度洋-太平洋海域的紅獅子魚(yú)首次被報(bào)道出現(xiàn)在美國(guó)加利福尼亞附近海域，隨后的十幾年逐漸發(fā)展成為美國(guó)南部大部分海域的優(yōu)勢(shì)魚(yú)種，對(duì)當(dāng)?shù)佤~(yú)類和無(wú)脊椎動(dòng)物的多樣性產(chǎn)生負(fù)面影響。直到2016年，科學(xué)家根據(jù)連續(xù)8 a的跟蹤調(diào)查和研究推斷，最終發(fā)現(xiàn)了紅獅子魚(yú)是通過(guò)壓載水轉(zhuǎn)運(yùn)至美國(guó)太平洋沿岸港口并最終成為入侵魚(yú)種^［19］。

3 船舶壓載水入侵魚(yú)類的傳統(tǒng)檢測(cè)方法

目前，壓載水中入侵魚(yú)類的監(jiān)測(cè)及鑒定方法包括采用鏡檢（或熒光染色后鏡檢）等傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)手段^{［17，20］}，或采用流式細(xì)胞技術(shù)、激光質(zhì)譜及透射光譜技術(shù)等方法監(jiān)測(cè)浮游植物和微生物等單細(xì)胞生物^［26-28］，這些方法能否用于壓載水中的魚(yú)類監(jiān)測(cè)還有待驗(yàn)證。調(diào)查時(shí)，壓載水滿倉(cāng)時(shí)通常采用浮游生物網(wǎng)、抄網(wǎng)和抽水泵捕獲魚(yú)類生物，在空倉(cāng)時(shí)通常采用肉眼觀察、先拍照后鑒定的方式。

采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法進(jìn)行壓載水中生物監(jiān)測(cè)可直觀鑒定所檢測(cè)生物并對(duì)樣本生物量化，有效區(qū)分活體和死亡個(gè)體，增加監(jiān)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定法的局限性是：1）效率低、費(fèi)用高^［26］，早期發(fā)現(xiàn)和快速采取措施是應(yīng)對(duì)生物入侵的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但在早期入侵階段，生物量較小，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法工作量大，形態(tài)鑒定試驗(yàn)周期長(zhǎng)，且容易低估潛在入侵風(fēng)險(xiǎn)，待檢測(cè)報(bào)告出來(lái)可能為時(shí)已晚，船舶或已靠港排放壓載水，使入侵防控變得被動(dòng)；2）對(duì)形態(tài)鑒定人員的專業(yè)知識(shí)水平要求高^［27］；3）靈敏度低，許多類群有變態(tài)發(fā)育的特點(diǎn)，不同生活史階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)和習(xí)性發(fā)生較大變化，部分類群在同一生活史時(shí)期的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)極為相似，增加了物種鑒定的難度，大多數(shù)情況也只能鑒定到科或科以上分類階元^［29］。采樣方式和物種自身形態(tài)特征也對(duì)魚(yú)類物種鑒定工作產(chǎn)生較大影響。樣品保存不當(dāng)導(dǎo)致形態(tài)特征缺失，給準(zhǔn)確的分類鑒定造成困難^［30］。目前亟需建立集快速、準(zhǔn)確、高靈敏度、高分辨率于一體的監(jiān)測(cè)壓載水外來(lái)魚(yú)種的試驗(yàn)方法。

4 環(huán)境DNA 宏條形碼技術(shù)的應(yīng)用

環(huán)境DNA（environment DNA，eDNA）是生物體釋放到環(huán)境中的DNA的總稱，主要來(lái)源于生物體的配子、皮膚碎屑、粘黏或排泄物等^［31］。該技術(shù)從環(huán)境樣品（水體、土壤、空氣等）中直接提取DNA開(kāi)展生物信息監(jiān)測(cè)，不分離任何目標(biāo)生物。

eDNA技術(shù)在20世紀(jì)80年代首先應(yīng)用在微生物的群落研究中。Ficetola等^［31］在2008年采用水中提取的DNA監(jiān)測(cè)到美國(guó)牛蛙的分布情況，開(kāi)啟了eDNA在水生生物實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用研究。該技術(shù)已應(yīng)用于生物多樣性評(píng)價(jià)、水生生物監(jiān)測(cè)和珍稀瀕危物種的保護(hù)等研究領(lǐng)域^［32-35］。DNA宏條形碼技術(shù)是采用基因組內(nèi)一段標(biāo)準(zhǔn)化的DNA片段鑒定生物物種的分子鑒定技術(shù)，目前在物種的快速鑒定和起源、進(jìn)化等研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用^［36-38］。eDNA宏條形碼技術(shù)通過(guò)提取環(huán)境樣品中的DNA并使用條形碼基因通過(guò)引物擴(kuò)增，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和二代測(cè)序等技術(shù)，在短時(shí)間內(nèi)獲得可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），通過(guò)與具有可靠物種分類信息的DNA條形碼參照序列比對(duì)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的物種鑒定及目標(biāo)物種的信息獲取^［39-41］。傳統(tǒng)的DNA條形碼技術(shù)僅從單一樣品中獲取DNA信息，eDNA 宏條形碼技術(shù)可直接從環(huán)境樣品或生物混合樣品中大批量識(shí)別物種^［41-42］，省時(shí)、高效、成本低，如圖1所示。

目前，eDNA宏條形碼技術(shù)應(yīng)用到船舶壓載水入侵生物的監(jiān)測(cè)研究處于發(fā)展階段^［43-50］，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)研究。2015年，Zaiko的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表關(guān)于eDNA 宏條形碼可用于壓載水生物多樣性調(diào)查和入侵生物監(jiān)測(cè)的研究結(jié)果，通過(guò)細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome oxidase subunit I，COI）基因開(kāi)展歐洲蝸牛（Peringia ulvae）這一入侵生物的監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究^［47］。2019年，Rey等^［49］采用eDNA 宏條形碼技術(shù)在壓載水中檢測(cè)到非本地物種的橈足類生物。Gerhard等^［50］采用16S rRNA基因?qū)γ绹?guó)20個(gè)港口41個(gè)壓載艙進(jìn)行基于eDNA 宏條形碼技術(shù)的微生物調(diào)查，結(jié)果顯示5艘商船壓載水中的大腸桿菌含量超標(biāo)，未達(dá)到壓載水排放標(biāo)準(zhǔn)。目前，基于eDNA 宏條形碼技術(shù)開(kāi)展壓載水中入侵魚(yú)類的調(diào)查研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

未來(lái)研究中可選擇我國(guó)航運(yùn)發(fā)達(dá)的沿海港口為研究區(qū)域，以外來(lái)入港船舶為研究對(duì)象，通過(guò)明確壓載水eDNA樣品采集的位置和途徑，設(shè)計(jì)針對(duì)船舶壓載水的高質(zhì)量的eDNA采樣方法，通過(guò)高通量測(cè)序和eDNA 宏條形碼分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)分析方法，準(zhǔn)確、快速鑒定我國(guó)海域船舶壓載水中的外來(lái)魚(yú)種。eDNA宏條形碼檢測(cè)比形態(tài)學(xué)檢測(cè)更靈敏，為提高物種的檢出率和降低假陽(yáng)性率，可基于eDNA宏條形碼技術(shù)進(jìn)行多方位采樣和設(shè)置陰性對(duì)照，對(duì)比港口附近海域本土魚(yú)種的調(diào)查研究，驗(yàn)證壓載水中外來(lái)魚(yú)種的鑒定結(jié)果。初步構(gòu)建通過(guò)船舶壓載水引至我國(guó)海域的有潛在入侵風(fēng)險(xiǎn)的外來(lái)魚(yú)種信息數(shù)據(jù)庫(kù)和物種DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)。完善基于eDNA 宏條形碼技術(shù)的壓載水外來(lái)魚(yú)種的鑒定方法，揭示外來(lái)魚(yú)種在中國(guó)海域入侵的潛在風(fēng)險(xiǎn)，向我國(guó)外來(lái)入侵物種防控工作發(fā)出預(yù)警，為我國(guó)壓載水處理和管控提供理論依據(jù)和資源信息共享平臺(tái)，為其他水生生物通過(guò)壓載水入侵我國(guó)海域的調(diào)查研究提供參考依據(jù)和技術(shù)支撐。

船舶壓載水外來(lái)入侵魚(yú)類監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)體系如圖2所示。分別采集、調(diào)查壓載艙中壓載水、船舶所在港口附近海域水樣，基于eDNA宏條形碼測(cè)序的技術(shù)手段，對(duì)壓載水和港口水域、近岸海域中的魚(yú)類物種信息進(jìn)行對(duì)比、排除，將測(cè)序片段與NCBI、EMBL、BOLD等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，參考船舶航行路徑和壓載水更換地點(diǎn)等數(shù)據(jù)信息，初步確定外來(lái)魚(yú)種信息。與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行相互印證，揭示壓載水引入外來(lái)魚(yú)類的種類組成，通過(guò)定量PCR開(kāi)展外來(lái)魚(yú)種的定量評(píng)估。結(jié)合歷史調(diào)查數(shù)據(jù)和公開(kāi)文獻(xiàn)報(bào)道，收集魚(yú)種自然分布海域的經(jīng)緯度、溫度、鹽度、深度、pH值、溶解氧等基礎(chǔ)環(huán)境參數(shù)，通過(guò)與我國(guó)近岸海域的相應(yīng)參數(shù)的對(duì)比分析，尋找不同海域間的異同，對(duì)比有記錄的成功入侵海洋魚(yú)類的共有特征及其與環(huán)境因子間的關(guān)系，初步探討外來(lái)魚(yú)種在我國(guó)海域成為入侵物種的潛在風(fēng)險(xiǎn)。構(gòu)建魚(yú)類通過(guò)壓載水引至我國(guó)海域的有潛在入侵風(fēng)險(xiǎn)的外來(lái)魚(yú)種信息庫(kù)。

5 新方法應(yīng)用的影響因素和局限性

科學(xué)合理的取樣方法是壓載水檢測(cè)的基礎(chǔ)，對(duì)生物入侵風(fēng)險(xiǎn)管理非常重要，但目前公約中未規(guī)定壓載水檢測(cè)采樣的標(biāo)準(zhǔn)化方法。船舶沒(méi)有專用的壓載水采樣口，可利用的采樣途徑有測(cè)深管、消防管道開(kāi)口、人孔、通氣孔和壓載水排放口，根據(jù)這些管、孔的大小可歸類為大孔采樣和小孔采樣，但每種采樣途徑都有一定的局限性。在對(duì)進(jìn)港船舶開(kāi)展壓載水生物監(jiān)測(cè)調(diào)查時(shí)，為保證監(jiān)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，根據(jù)不同的船型和裝載情況，選擇的取樣具體位置和方法也不同^［51-52］。需摸索出一套合理、可行的采集eDNA樣品的取樣方法，保證所采集到的水樣具有代表性，是保證研究結(jié)果準(zhǔn)確性的前提。采集壓載水水樣，通過(guò)采水器法、潛水泵法、隔膜泵法和管道采樣法及不同的采樣途徑，采取控制變量等方法，結(jié)合核酸定量分析和定量PCR檢測(cè)，探索eDNA的最佳采樣途徑，確定適用于壓載水的高質(zhì)量eDNA采樣方法。優(yōu)化樣品收集保存技術(shù)，有效地規(guī)避樣品間交叉污染，設(shè)置陰性對(duì)照，提升鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

不同的數(shù)據(jù)分析方式可能給快速檢測(cè)外來(lái)魚(yú)種帶來(lái)不同的檢測(cè)結(jié)果，比如分項(xiàng)目閱讀值的不同設(shè)置方法可能引起結(jié)果的假陰性，影響外來(lái)物種的有效鑒別和檢出，適當(dāng)選擇和設(shè)置生物信息學(xué)工具及參數(shù)尤為重要^［53］，注意開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確性更高的軟件包，增強(qiáng)不同研究結(jié)果的可對(duì)比性及準(zhǔn)確性。

參考數(shù)據(jù)庫(kù)的不完整性和不準(zhǔn)確性是限制采用eDNA宏條形碼技術(shù)進(jìn)行船舶壓載水中外來(lái)物種檢測(cè)的主要障礙^［54］，數(shù)據(jù)庫(kù)不完整將大大降低入侵魚(yú)種的檢出率，應(yīng)盡快構(gòu)建完善的物種DNA條形碼參考數(shù)據(jù)庫(kù)、建立全球范圍的資源信息共享和應(yīng)用平臺(tái)，推動(dòng)該技術(shù)的應(yīng)用與推廣。檢測(cè)外來(lái)魚(yú)種應(yīng)建立健全外來(lái)入侵魚(yú)種和各港口附近海域本土魚(yú)類資料數(shù)據(jù)庫(kù)，以便準(zhǔn)確判定檢測(cè)到的生物是否為外來(lái)入侵魚(yú)種。

最優(yōu)目標(biāo)基因的選擇是影響采用eDNA宏條形碼技術(shù)進(jìn)行船舶壓載水中外來(lái)物種檢測(cè)的另一重要因素。目前已有不少針對(duì)魚(yú)類設(shè)計(jì)的eDNA宏條形碼通用引物^［55-57］，其目標(biāo)基因彼此存在差異，導(dǎo)致魚(yú)類鑒定方面的通用性差異較大。需根據(jù)實(shí)際調(diào)查的海域狀況和有記錄的魚(yú)類出現(xiàn)記錄及具體的預(yù)試驗(yàn)等設(shè)定目標(biāo)基因。魚(yú)類種間差異的閾值認(rèn)定也不固定。標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物DNA 條形碼主要為線粒體細(xì)胞色素 c 氧化酶亞基 I 基因，但魚(yú)類eDNA 宏條形碼主要選用線粒體 12S 核糖體或 16S 核糖體基因，變異速度不穩(wěn)定^［58］，且擴(kuò)增片段多小于 200 bp（堿基對(duì)base-pair）。魚(yú)類物種系統(tǒng)發(fā)育分析過(guò)程的種間差異閾值目前也尚無(wú)定論。

在船舶壓載水采用eDNA宏條形碼技術(shù)鑒定入侵魚(yú)類的種類相對(duì)簡(jiǎn)單，但如何實(shí)現(xiàn)入侵魚(yú)類的定量評(píng)估仍存在爭(zhēng)議，未來(lái)可開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確鑒別特定外來(lái)物種和相關(guān)近緣物種的特異性條形碼，探索影響eDNA與生物量線性關(guān)系的生物和非生物因素，校正優(yōu)化eDNA定量方法^［59］等方面的研究手段，促進(jìn)eDNA技術(shù)在壓載水入侵生物防治中的應(yīng)用。

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Fast detection technology for alien invasive fish in ship ballast water

LIU Lu¹， CHEN Zhi^2，3， LI Yang⁴， FAN Xin^1*

1.Naval Architecture and Port Engineering College， Shandong Jiaotong University， Weihai 264209，China;

2.Key Laboratory of Utilization and Conservation for Tropical Marine Bioresources， Hainan Tropical Ocean University， Ministry of Education，

Sanya 572022，China;3.Hainan Key Laboratory for Conservation and Utilization of Tropical Marine Fishery Resources，

Hainan Tropical Ocean University， Sanya 572022，China; 4.Weihai Ecological Environment Monitoring Center， Weihai 264200 China

Abstract：In order to eliminate the potential threat of alien invasive fish in ballast water to the ecological environment， and solve the shortcomings and limitations of traditional invasive species detection methods， traditional investigation methods combined with environmental DNA macro barcode technology are used to identify species and obtain information about target species in a large number of samples in ballast water. A database of alien fish species is built， and qualitative detection and quantitative evaluation are carried out. Monitoring theories and methods suitable for China′s national conditions are explored and established to comprehensively analyze and evaluate the potential invasion risk of fish. Theoretical basis for ballast water treatment and control in many ports in China is provided， and finally technical support for reducing the invasion risk of fish and even reaching zero risk is offered.

Keywords：ship ballast water; invasive fish; rapid detection; environmental DNA

（責(zé)任編輯：王惠）