麥胚凝集素慢病毒載體構建技術引入組織工程實驗教學實踐

覃祖火 樊 強 馬楚卿 田子恒 王 娟*

1.海南醫學院基礎醫學與生命科學學院 海南海口 571199;2.青島市即墨人民醫院 山東青島 266299;3.海南醫學院第二臨床學院 海南海口 571199;4.濟寧醫學院臨床醫學院 山東濟寧 272002

組織工程也稱為“再生醫學”,是指利用生物活性物質,通過體外培養或構建的方法,再造或者修復器官及組織的技術。“組織工程”是由美國國家科學基金委員會在1987年提出,近年來正在興起的一門新學科,屬于生物高技術范疇,是生命科學領域的一門重要專業課程[1]。組織工程的實驗教學對于培養學生的實踐能力和科研思維至關重要。目前,國內已有不少高等院校開設了組織工程學實驗課程,但課程內容的系統性和連續性有待提高[2-4]。

我校開設的組織工程實驗課內容主要涉及種子細胞培養和支架材料體外重建等方面,主講教師根據學情分析,從課程內容、課程設置等方面進行了系列改革。組織工程及其實驗課程安排在大三上學期,該階段學生已學習了細胞生物學、分子生物學、發育生物學、生物材料學、細胞工程等課程。2021年,主講教師對組織工程實驗課程內容進行了調整,培養人源脂肪干細胞(human Adipose Derived Stem Cells,hADSCs)作為種子細胞,構建麥胚凝集素(Wheat Germ Agglutinin,WGA)慢病毒載體并感染hADSCs,并將感染后的hADSCs注入小鼠的腦卒中模型的大腦損傷部位,觀察hADSCs對腦卒中的療效。該實驗將為hADSCs對腦損傷的臨床治療提供技術參考。該實驗整合后為綜合性設計性實驗,可以將學生的多學科理論知識有效地融合起來,培養學生的創新能力和團隊協作能力。

1 WGA實驗教學方案

1.1 實驗原理

麥胚凝集素是一種可以從多種谷類作物中提取的蛋白質[5]。WGA通過誘導細胞膜表面上的糖類和蛋白質的相互作用,從而參與宿主細胞被細菌或病毒感染的初始過程,對免疫學、組織器官學等醫學研究具有重要意義[6]。WGA是研究細胞表面結構受體的重要探針,對脂肪代謝、細胞膜通透性、成纖維細胞增殖抑制、免疫反應等都有調節作用[7]。

有研究用小鼠和果蠅作為模式生物,將WGA-cDNA片段轉入質粒載體中,腺病毒包裝后感染細胞,當神經元特異啟動子表達后,導入的目的基因即可表達,從而通過觀察WGA,便能達到示蹤的效果[8]。在神經退行性疾病如阿爾茲海默病、肌萎縮側索硬化等的研究和治療中,對相關的神經元進行示蹤顯得至關重要[9]。

該實驗是將WGA轉入慢病毒載體Plvx-IRES-ZsGreen1中進行包裝,再將構建好的質粒和其他三種包裝質粒(RPEV、PRRE、VSVG)共轉染293T細胞,收集病毒后感染人源脂肪干細胞(hADSCs),用hADSCs移植治療小鼠腦卒中模型的大腦損傷區。治療兩周后,取小鼠的腦損傷部位制作冰凍切片,免疫熒光鑒定示蹤hADSCs的遷移能力。該實驗為干細胞治療腦卒中,提供顯色示蹤的方法。

1.2 實驗目的

本實驗以WGA為研究對象,實驗內容包括重組慢病毒表達載體Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1的構建、293T細胞及hADSCs的培養、共轉染、干細胞移植治療等內容。干細胞治療技術是一門先進的醫學技術,2009年衛生部將干細胞技術歸入“第三類醫療技術”。學生自主設計實驗,參與到實驗的每一個環節,該綜合性、設計性實驗激發了他們的學習興趣,提高了創新思維能力和動手操作能力。

1.3 實驗材料

生物材料與試劑:感受態細胞、293T細胞(人胚腎細胞)、WGA-d質粒、plvx-ires-ZsGreen1載體質粒、hADSCs(人源脂肪干細胞)、DMEM/F12培養基、胎牛血清等。

實驗儀器:高速冷凍離心機、CO2培養箱、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等。

1.4 實驗方法

(1)構建重組慢病毒表達載體Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1。用限制性內切酶EcoRⅠ分別酶切目的片段模板質粒WGA-d和慢病毒載體質粒Plvx-IRES-ZsGreen1。瓊脂糖凝膠電泳分離后,回收純化目的條帶,用DNA連接酶將純化的WGA片段與Plvx-IRES-ZsGreen1載體片段連接。連接產物轉化DH5α感受態細胞,挑選陽性克隆,酶切并測序鑒定。

(2)培養293T細胞及hADSCs。293T細胞培養體系:DMEM+10%FBS;0.075%I型膠原酶37℃消化人健康抽脂手術來源脂肪50min,離心后去上清,DMEM/F12+10%FBS重懸沉淀,37℃、5%CO2恒溫培養箱接種培養293T細胞及hADSCs。

(3)Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1、RPEV、PRRE及VSVG四種質粒共轉染293T細胞,37℃、5%CO2恒溫培養箱中過夜培養,24h后換液,繼續培養48h后,熒光顯微鏡下觀察病毒包裝結果。

(4)感染293T細胞72h后,收集293T細胞的培養液,并用0.45μm微孔濾器過濾。向生長狀態良好、匯合率達80%左右的hADSCs中,加入原培養液體積的病毒液,進行病毒感染。

(5)感染效果檢測。棄去24孔板細胞的培養液,加入4%多聚甲醛溶液500μL,固定20min;1mL0.2%吐溫-20℃處理10min;封閉液處理60min;加入一抗anti-WGA 500μL,4℃敷育過夜;PBS洗滌3次后,加入500μL二抗,室溫敷育2h;避光加入DAPI(1μg/mL)500μL,室溫敷育15min。熒光顯微鏡觀察結果。

(6)hADSCs移植治療小鼠MCAO模型,制作腦冰凍切片并進行免疫組織化學染色。制備C57/BL6雌性小鼠大腦中動脈阻塞MCAO模型。MCAO術后7d,用WGA慢病毒感染的hADSCs移植治療小鼠MCAO模型。采用原位注射的方式,將hADSCs(108細胞/只)均勻多點注入腦梗死損傷區域,緩慢退針,以防止細胞懸液外溢。一個月后,取小鼠腦損傷區制作冰凍切片,免疫組織化學染色后,示蹤hADSCs在體內的存活及增殖情況。

1.5 實驗結果

Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1感染的hADSCs移植治療小鼠MCAO模型一個月后,取腦梗死區域制備冰凍切片,免疫組織化學染色示蹤hADSCs在小鼠體內的存活、遷移及增殖情況。WGA蛋白顯示紅色熒光(下圖A),Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1重組載體表達綠色熒光蛋白ZsGreen1(下圖B),細胞核經DAPI染色后顯示藍色(下圖C),下圖D為合并后結果。實驗結果表明hADSCs在小鼠體內存活、遷移并大量增殖。

免疫染色追蹤MCAO小鼠模型腦損傷區的hADSCs圖

2 教學效果

與傳統的實驗相比,引入的WGA實驗具有明顯的綜合性、設計性、創新性的特點,將六個獨立的小實驗整合成一個系統性的大實驗。在實驗過程中,學生自主設計實驗,操作實驗,認真參與到實驗的每一個具體環節中。這六個小實驗,環環相扣,前一個實驗是后一個實驗的基礎,其結果決定了后一個實驗能否成功。當學生發現Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1感染的hADSCs移植治療小鼠MCAO模型后,小鼠的腦功能得到恢復,hADSCs在小鼠體內存活并增殖,學生非常興奮。學生們彼此之間團隊協作,共同完成所有實驗,實驗達到預期結果,他們的成就感和滿足感油然而生。也有部分學生最終沒有觀察到小鼠腦卒中癥狀的減輕,需要引導他們找出實驗失敗的原因。學生們從該實驗中得到了多方面的鍛煉,既開闊了思路,提高了動手能力,又進一步理解并鞏固了理論知識[10]。

結語

Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1感染的hADSCs移植治療小鼠MCAO模型,該實驗具有綜合性、設計性和創新性的特點。將該實驗技術引入組織工程實驗教學中,大大提高了學生的主動學習能力和實踐能力[11]。學生們可以在實驗過程中鞏固生物學基本原理,拓展創新思維,提高科研能力,為他們今后的工作或深造打下堅實基礎[12]。