miRNA-181a、胱天蛋白酶富集域家族成員11、核因子κB在彌漫大B 細胞淋巴瘤患者中的表達及臨床意義△

陳青，郭廣秀，王建

贛州市人民醫院病理科，江西 贛州 341000

彌漫大B 細胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤中最常見的亞型，在生物學、遺傳學、形態學等方面均具有高度異質性[1-2]。臨床多采用利妥昔單抗聯合環磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松（CHOP）方案治療彌漫大B 細胞淋巴瘤，60%～70%的患者可治愈，但仍有部分患者對治療的反應較差，且易復發或進展[3-4]。研究表明，彌漫大B 細胞淋巴瘤的發病與體內微小RNA（microRNA，miRNA）的表達密切相關，miRNA-181a 可抑制細胞分化過程中關鍵基因的表達，從而抑制B 淋巴細胞惡性轉化，可能參與彌漫大B 細胞淋巴瘤的發生發展[5-6]。胱天蛋白酶富集域家族成員11（caspase recruitment domain family member 11，CARD11）可介導獲得性免疫反應，增強核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的表達，誘發細胞凋亡、信號轉導等，對彌漫大B 細胞淋巴瘤的發生發展具有一定的促進作用[7-8]。有關研究已證實CARD11 在彌漫大B 細胞淋巴瘤淋巴結組織中表達，且是患者遠期生存的獨立影響因素[9]。明確miRNA-181a、CARD11 與彌漫大B 細胞淋巴瘤病情進展的關系對及時采取針對性干預治療至關重要，基于此，本研究探討miRNA-181a、CARD11、NF-κB在彌漫大B 細胞淋巴瘤患者中的表達及臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014 年7 月至2020 年6 月于贛州市人民醫院就診的彌漫大B 細胞淋巴瘤患者。納入標準：①經影像學和病理學檢查首次確診為彌漫大B 細胞淋巴瘤；②可耐受利妥昔單抗聯合CHOP 治療方案，一線治療至少接受6 個周期的標準治療方案；③年齡為25～73 歲；④臨床資料完整。排除標準：①惰性淋巴瘤轉化為彌漫大B 細胞淋巴瘤；②合并其他惡性腫瘤；③合并嚴重肝、腎功能異常。依據納入和排除標準，本研究納入85 例彌漫大B 細胞淋巴瘤患者作為觀察組，男48 例，女37 例；年齡25～73 歲，平均（64.56±8.01）歲。另選取同期贛州市人民醫院收治的60 例增生性淋巴結炎患者作為對照組，男35 例，女25 例；年齡28～69 歲，平均（65.03±7.86）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR）檢測miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量

采集兩組患者治療前的淋巴結組織，切開并應用10%福爾馬林固定，常規脫水及切片，應用總RNA提取試劑提取細胞總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），應用PCR 儀進行PCR 擴增。PCR 條件：95 ℃5min，95 ℃10 s，60 ℃20 s，共50 個循環；95 ℃10 s，60 ℃10 s，40 ℃30 s。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參，采用2-ΔΔCt法檢測miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA相對表達量。GAPDH上游引物5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGT-3'，下游引物5'-GTCGCTGTTGAAGTCAGAGGAG-3'；miRNA-181a 上游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCAC3'，下游引物5'- ACACTCCAGCTTCACCATTCAACGCTGTCG-3'；CARD11上游引物5'-CAGAGGAGCTGCGAGACAA-3'，下游引物5'-GGTGCTTGTACATTTCACAGTCC-3'；NF-κB上游引物5'-GGCGTGTATAAGGGGCTATAA-3'，下游引物5'-TTTTCCCGATCTCCCAGCTC-3'。

1.3 資料收集

收集彌漫大B 細胞淋巴瘤患者的臨床資料，包括性別、年齡、淋巴瘤結外累及數目、臨床分期、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、國際預后指數（international prognostic index，IPI）評分[10]。臨床分期按照Ann Arbor-Cotswolds 分期標準[11]進行評估。

1.4 療效評價標準

根據實體瘤療效評價標準（response evaluation criteria in solid tumor，RECIST）[12]評價兩組患者的臨床療效。完全緩解（complete response，CR）：腫瘤病灶完全消失，至少持續1 個月；部分緩解（partial response，PR）：腫瘤病灶長徑總和與基線相比減少≥30%，至少持續1 個月；疾病穩定（stable disease，SD）：腫瘤病灶長徑總和與基線相比減少＜30%或增加＜20%；疾病進展（progressive disease，PD）：腫瘤病灶長徑總和與基線相比增加≥20%或出現新病灶。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對數據進行統計分析，符合正態分布且方差齊的計量資料以均數±標準差（±s）表示，3 組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線及曲線下面積（area under the curve，AUC）分析miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨及聯合檢測對彌漫大B細胞淋巴瘤患者臨床分期的診斷價值及對療效的預測價值；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床特征彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量的比較

不同性別、年齡、血清LDH 水平、結外累及數目彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；Ann Arbor 分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評分為3～5 分彌漫大B細胞淋巴瘤患者miRNA-181a 相對表達量分別明顯高于Ann Arbor 分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI 評分為0～2分的患者，差異均有統計學意義（t=6.644、3.343，P＜0.01）。不同性別、年齡、血清LDH 水平彌漫大B 細胞淋巴瘤患者CARD11mRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；結外累及數目＞1 個、Ann Arbor 分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評分為3～5 分彌漫大B 細胞淋巴瘤患者CARD11mRNA相對表達量分別明顯高于結外累及數目≤1 個、Ann Arbor 分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI 評分為0～2 分的患者，差異均有統計學意義（t=3.064、8.461、7.537，P＜0.01）。不同性別、年齡、血清LDH 水平彌漫大B 細胞淋巴瘤患者NF-κBmRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；結外累及數目＞1 個、Ann Arbor 分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評分為3～5 分彌漫大B 細胞淋巴瘤患者NF-κBmRNA 相對表達量分別明顯高于結外累及數目≤1 個、Ann Arbor 分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI 評分為0～2 分的患者，差異均有統計學意義（t=3.057、11.967、2.394，P＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征彌漫大B細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量的比較

2.2 觀察組和對照組患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量的比較

Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量均高于對照組，Ⅲ～Ⅳ期彌漫大B細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA相對表達量均高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 觀察組和對照組患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量的比較（±s）

表2 觀察組和對照組患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與Ⅰ～Ⅱ期比較，P＜0.05

組別觀察組Ⅰ～Ⅱ期（n=41）Ⅲ～Ⅳ期（n=44）對照組（n=60）F值P值miRNA-181a CARD11 mRNA NF-κB mRNA 1.21±0.24a 1.62±0.32ab 0.56±0.11 284.308＜0.01 0.92±0.13a 1.21±0.18ab 0.48±0.07 422.493＜0.01 1.25±0.21a 1.86±0.26ab 0.66±0.11 484.608＜0.01

2.3 不同療效彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量的比較

療效為CR/PR/SD 彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量均低于療效為PD 的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同療效彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相對表達量的比較（±s）

表3 不同療效彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相對表達量的比較（±s）

療效CR/PR/SD（n=65）PD（n=20）t值P值miRNA-181a 1.34±0.21 1.68±0.26 5.978＜0.01 CARD11 mRNA 1.04±0.19 1.17±0.20 2.643＜0.05 NF-κB mRNA 1.49±0.28 1.84±0.26 4.967＜0.01

2.4 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 單獨及聯合檢測對彌漫大B細胞淋巴瘤患者臨床分期的診斷價值

ROC 曲線顯示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯合檢測診斷彌漫大B細胞淋巴瘤患者臨床分期的AUC為0.968，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨檢測的0.852、0.841、0.830。（表4、圖1）

圖1 miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨及聯合檢測診斷彌漫大B細胞淋巴瘤患者臨床分期的ROC曲線

表4 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 單獨及聯合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤患者臨床分期的診斷價值

2.5 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 單獨及聯合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤患者療效的預測價值

ROC 曲線顯示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯合檢測預測彌漫大B 細胞淋巴瘤患者療效的AUC 為0.953，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨檢測的0.847、0.684、0.816。（表5、圖2）

圖2 miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨及聯合檢測預測彌漫大B細胞淋巴瘤患者療效的ROC曲線

表5 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 單獨及聯合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤患者療效的預測價值

3 討論

彌漫大B 細胞淋巴瘤的異質性較強，標準治療具有較好的治療效果，然而其治療方式單一，仍有許多患者治療失敗，導致預后較差，隨著病情進展可累及組織或器官，導致腫瘤浸潤、腫塊壓迫及出血等[13-14]。臨床上常采用IPI 評分評估彌漫大B 細胞淋巴瘤病情危險程度，然而其評估價值具有一定的局限性[15]。因此，預測腫瘤的發展情況并及時給予相應的治療，對于提高患者生存率具有重要意義。既往研究顯示，miRNA 可通過調節細胞分化、增殖、凋亡等過程參與腫瘤的發生發展，miRNA-181a 是T 淋巴細胞的敏感性和選擇性調節器[16]。CARD11 與腫瘤進展和細胞侵襲密切相關，主要通過NF-κB 影響細胞凋亡、信號轉導等[17-18]，但關于二者與彌漫大B 細胞淋巴瘤病情進展的關系尚未見報道。

本研究比較對照組與觀察組患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量，結果顯示，Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期觀察組患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量均高于對照組，且Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評分為3～5 分彌漫大B 細胞淋巴瘤患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量均高于Ⅰ～Ⅱ期、IPI 評分為0～2 分的患者。表明miRNA-181a、CARD11、NF-κB參與彌漫大B 細胞淋巴瘤的發生發展，且隨著病情進展，其表達水平升高。這可能是因為，miRNA-181a 可通過調控下游靶基因的表達參與彌漫大B 細胞淋巴瘤的發生發展，還可通過抑制CARD11 的表達抑制腫瘤生長。CARD11 是一種支架蛋白，可介導獲得性免疫反應，調節細胞膜和細胞骨架之間的相互作用。高表達的CARD11 可激活NF-κB 上游信號分子，導致NF-κB表達升高，抑制T 細胞增殖，從而誘導其凋亡。

本研究比較不同臨床分期彌漫大B 細胞淋巴瘤患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量，結果顯示，Ⅲ～Ⅳ期彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量均高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。表明miRNA-181a、CARD11、NF-κB表達水平與彌漫大B 細胞淋巴瘤患者病情進展有關，病情越嚴重，其表達水平越高。分析原因如下：miRNA-181a 在組織分化、細胞增殖和凋亡過程中扮演了重要角色，可通過調控多種抑癌基因和原癌基因的表達對腫瘤的發生發展過程進行調控[19]。CARD11 在T 和B 細胞誘導的NF-κB 活化過程中發揮了關鍵作用，可增強組成型NF-κB 的活性，促進NF-κB 活性相關抗原受體表達，從而參與彌漫大B 細胞淋巴瘤的發展過程[20]。NF-κB 是一種從B 細胞的細胞核中提取出來的可與免疫球蛋白κ鏈基因特異性結合的核蛋白因子，家族中每個成員N 末端均含有兩種類似免疫球蛋白的結構域[21-22]；NF-κB 廣泛存在于各種類型的細胞中，當機體受到疾病侵襲時，被激活的NF-κB 參與多種細胞因子（如黏附因子、轉錄因子、細胞因子等）對刺激的反應，從而促進腫瘤細胞增殖、轉移，還可促進腫瘤新生血管生成及耐藥，當彌漫大B 細胞淋巴瘤患者疾病進展時，其表達水平隨之升高，與相關研究報道的結果一致[23-24]。本研究結果還顯示，療效為CR/PR/SD彌漫大B細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量均低于療效為PD 的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示通過監測彌漫大B 細胞淋巴瘤患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 水平可對治療效果進行判斷，miRNA-181a、CARD11、NF-κB高表達可能反映患者預后較差。本研究采用ROC 曲線評估miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨及聯合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤患者臨床分期的診斷價值，結果顯示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯合檢測診斷彌漫大B 細胞淋巴瘤患者臨床分期的AUC 為0.968，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨檢測的0.852、0.841、0.830。采用ROC 曲線評估miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨及聯合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤患者預后的預測價值，結果顯示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯合檢測預測彌漫大B 細胞淋巴瘤患者療效的AUC 為0.953，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨檢測的0.847、0.684、0.816。表明miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤的診斷價值較高，對預后的預測價值較高。

綜上所述，miRNA-181a、CARD11、NF-κB可作為彌漫大B 細胞淋巴瘤患者病情監測和預后預測指標，其表達水平升高提示患者病情可能加重，三者聯合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤的診斷價值較高，且對預后的預測價值較高。