爪蟾驅動蛋白樣蛋白2 靶蛋白在肝細胞癌中的表達及臨床意義

張衛(wèi)彬，董佳，索立達，梁向南，武云飛，邱春瑜，李博，鄭彬

1錦州市中心醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121000

2錦州市婦嬰醫(yī)院放射線科，遼寧 錦州 121000

3大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝膽外科，遼寧 大連 112000

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種全球性發(fā)病的惡性腫瘤，其發(fā)病例數(shù)占原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）的75%～85%，且多數(shù)患者5 年生存率較低[1]。由于中國慢性乙型肝炎的發(fā)病率較高，以致HCC 的發(fā)病率較歐美發(fā)達國家高[2]，發(fā)病例數(shù)超全球HCC 患者的1/2。雖然手術治療和放化療有利于提高HCC 患者的5 年生存率，但易導致多種并發(fā)癥，影響患者生活質量[3]。目前，雖然全世界的研究者對HCC 的發(fā)病機制進行了廣泛且深入的研究，但仍未完全闡明。有學者認為HCC 的發(fā)病與癌基因的表達密切相關[4]。因此，探討癌基因的表達與HCC 發(fā)病之間的關系具有重要的臨床意義。爪蟾驅動蛋白樣蛋白2 靶蛋白（targeting protein for xenopus kinesin-like protein 2，TPX2）是一種蛋白質編碼基因，最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾蜍卵中，具有促進染色質微管成核、調控紡錘體形成的功能，是一種與細胞核增殖微管密切相關的蛋白[5]。而且，TPX2 可調控極光激酶A（aurora kinase A，AURKA），將AURKA 錨定于有絲分裂紡錘體微管[6]。相關文獻報道，TPX2 在多種疾病（包括色素性視網(wǎng)膜炎、宮頸癌、結直腸癌、乳腺癌以及胃癌等）中高表達且影響患者預后[7-11]。然而，目前尚沒有學者對TPX2 在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用機制進行深入研究。因此，本研究利用生物信息學方法分析TPX2 在HCC 中的表達情況及其對患者預后的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

數(shù)據(jù)來源于各網(wǎng)絡在線共享可用數(shù)據(jù)庫，均是以癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫相關數(shù)據(jù)為基礎，分別為GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php）、K-M Plot 數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）、UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）、HPA 數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）、ACLBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.aclbi.com/static/index.html）。

1.2 數(shù)據(jù)庫分析方法

通過UALCAN 與K-M Plot 數(shù)據(jù)庫分析TPX2蛋白和mRNA 在HCC 組織中的表達水平及其與患者預后的關系。利用HPA 數(shù)據(jù)庫分析TPX2 蛋白在HCC 組織中的表達水平。

利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫對HCC 組織中TPX2 與腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）的相關性進行分析；再利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析TPX2 在HCC組織中的表達水平與TP53突變之間的相關性。

利用ACLBI 數(shù)據(jù)庫分析TPX2 在HCC 組織中的表達水平及其對患者預后的風險評估，并通過受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線中的曲線下面積（area under the curve，AUC）判斷TPX2 對HCC 患者預后的預測價值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析法；繪制ROC曲線，分析TPX2 對HCC 患者預后的預測價值；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TPX2 在HCC 中的表達及與預后的關系

UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，不同分期和分級HCC 組織中TPX2mRNA 表達水平均高于正常組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表1、表2）

表1 正常組織和不同分期HCC 組織中TPX2 mRNA 表達水平的比較[M（P25，P75）]

表2 正常組織和不同分級HCC 組織中TPX2 mRNA 表達水平的比較[M（P25，P75）]

K-M Plot 數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，TPX2 低表達HCC 患者的無復發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）、總生存期（overall survival，OS）、無進展生存期（progression-free survival，PFS）及疾病特異性生存期（disease-specific survival，DSS）均優(yōu)于TPX2 高表達患者，差異均有統(tǒng)計學意義（HR=2.03、2.88、1.62、1.58，P＜0.05）。（圖1）

圖1 不同TPX2表達情況HCC患者的生存曲線

HPA數(shù)據(jù)庫免疫組化分析結果顯示，HCC組織中TPX2蛋白陽性表達率高于正常肝組織。（圖2）

圖2 HPA數(shù)據(jù)庫免疫組化分析TPX2在正常肝組織和HCC組織中的表達（免疫組化染色，×200）

2.2 TPX2 與TP53 的相關性分析

UALCAN 與GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，HCC 組織中TPX2 與TP53 的表達呈正相關（r=0.34，P＜0.05），且TP53突變組TPX2mRNA 表達水平為12.25（7.08，16.77），高于TP53未突變組的4.29（2.15，6.64），差異有統(tǒng)計學意義（Z=180.183，P＜0.05）。

2.3 TPX2 對HCC 患者預后的預測價值

ACLBI數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，隨著TPX2表達的增高，患者預后不良風險增加（圖3A）；TPX2低表達HCC患者的OS明顯優(yōu)于TPX2高表達患者，差異有統(tǒng)計學意義（HR=2.057，P＜0.01）（圖3B）；TPX2表達預測HCC 患者1、3、5 年OS 的ROC 曲線的AUC 分別為0.731（95%CI：0.659～0.803）、0.664（95%CI：0.588～0.739）和0.644（95%CI：0.551～0.738）（圖3C）。

圖3 TPX2表達對HCC患者預后的預測價值

3 討論

HCC 雖然是由多種致病因素和遺傳因素協(xié)同作用導致的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[12-13]，但致病癌基因在其發(fā)生發(fā)展過程中同樣發(fā)揮重要作用。目前對HCC 相關癌基因的研究還不夠深入，又缺乏相應的靶向治療藥物，從而難以準確預測患者預后[14]。因此，迫切需要尋找預測患者預后的生物標志物。

TPX2位于染色體20q11.21，可通過其羧基末端結構域介導細胞著絲粒處微管組裝，并受Ran-GFP 調控，在有絲分裂早期被釋放，進而與AURKA 協(xié)同促進紡錘體裝配的起始[15]；而且，TPX2 通過促進AURKA“Thr-288”自磷酸化從而激活AURKA，并保護該殘基免于去磷酸化[16]。TPX2 與細胞周期密切相關，其表達可見于細胞G1期向S 期過渡時期，而消失于細胞質分裂期[17]。研究報道，TPX2 在惡性腫瘤組織中異常表達，且由于TPX2中心體異常擴增，常導致DNA 異倍體以及多倍體形成，造成腫瘤細胞大量增殖與惡化，并影響細胞周期與細胞凋亡[18]。因此，TPX2 的異常表達對預測惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復發(fā)與轉移具有重要價值。

研究發(fā)現(xiàn)，TPX2 在大部分腫瘤組織中高表達，不利于患者的OS。同時也發(fā)現(xiàn)，TPX2及其共表達基因在HCC 組織中均高表達，是患者預后的危險因素，不利于患者的OS。此外，TPX2與其共表達基因的基因本位（Gene Ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集情況較一致。有學者通過對43 例神經(jīng)母細胞瘤進行研究發(fā)現(xiàn)，TPX2 可正向調節(jié)神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖和細胞周期，并通過增強細胞對凋亡的抵抗力促進細胞存活，從而不利于神經(jīng)母細胞瘤患者的OS；而且，研究認為，TPX2 在神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中起致癌作用，可作為神經(jīng)母細胞瘤患者潛在的預后標志物[19]。此外，另有研究通過實驗分析3952 例乳腺癌患者的TPX2 表達水平發(fā)現(xiàn)，TPX2在乳腺癌中顯著高表達，且不利于患者的OS，并認為其可用作乳腺癌的潛在治療靶點[20]。Wang 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內膜癌組織中TPX2mRNA 和蛋白均高表達，且與患者預后不良有關，是子宮內膜癌的易感基因。Sui 等[22]分析250 例食管癌組織與癌旁組織發(fā)現(xiàn)，TPX2 在食管癌組織中的表達水平高于癌旁組織，且不利于患者的5 年OS，可作為評估食管癌患者預后的重要生物標志物。Zhu 等[23]通過分析HCC 組織中TPX2 的表達水平發(fā)現(xiàn)，其表達水平顯著上調，并與患者種族、年齡、體重、臨床分期和腫瘤分級相關，且不利于患者的OS、PFS、DFS及DSS。此外，也有文獻報道，乙肝病毒可導致染色體著絲粒處變異，從而影響紡錘體與著絲粒的附著，最終造成染色體分離困難[24]。因此，眾多學者在不同領域獲得的研究結果均一致認為TPX2在腫瘤組織中高表達，不利于患者預后，與本研究結果一致。

TPX2 的表達與免疫細胞浸潤和TP53突變具有相關性。Wang 等[25]通過研究發(fā)現(xiàn)，TPX2 可通過核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路調節(jié)CXC 趨化因子受體5（C-X-C motif chemokine receptor 5，CXCR5），維持HCC 中CD8+T 細胞中的抗腫瘤作用。此外，有研究者認為TPX2 可與人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）-A+021結合，從而更易被樹突狀細胞識別，增強T 淋巴細胞殺滅腫瘤細胞的能力[26]。國外學者對253 例侵襲性乳腺癌組織進行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，TPX2 過表達與侵襲性乳腺癌之間存在明顯相關性，并認為TPX2 過表達常發(fā)生在TP53突變和倍體升高的情況下[27]。本研究通過分析發(fā)現(xiàn)，TPX2 在HCC 中高表達，且TPX2 高表達更加不利于患者預后；同時，HCC 組織中TPX2 與TP53 表達呈正相關，且TP53突變組TPX2mRNA 表達水平高于TP53未突變組。本研究結果與國外學者在侵襲性乳腺癌研究中得到的結果一致。有研究者認為，TPX2 在HCC 中的致病機制主要是其高表達改變了細胞核中染色體分離的調節(jié)，導致細胞有絲分裂和染色體不穩(wěn)定[28]。TPX2可能是一種癌基因，在HCC 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并與免疫細胞浸潤和TP53突變有關。

通路分析發(fā)現(xiàn)，TPX2 在HCC 中與磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號通路顯著相關，而PI3K/AKT/MTOR 信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展、復發(fā)以及轉移進程中發(fā)揮重要作用，且AKT 的活化與腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲密切相關[29]。因此，TPX2 可能與惡性腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲有關。Huang等[30]通過多種實驗技術檢測HCC 組織、鄰近正常肝組織以及HCC 細胞系中TPX2mRNA 和蛋白表達發(fā)現(xiàn)，TPX2 可通過調節(jié)PI3K/AKT 信號通路抑制HCC 的生長，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，認為TPX2 可能是治療HCC 的潛在靶標。而Zou 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，敲低TPX2表達，可誘導G2、M 期停滯，從而促進膽管癌細胞凋亡并抑制細胞的侵襲和遷移。此外，TPX2 與上皮-間充質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）通路基因基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、Slug 以及扭轉家族bHLH 轉錄因子1（twist family bHLH transcription factor 1，TWIST1）密切相關，而且其在DNA 損傷反應中發(fā)揮放大作用[32]。有研究表明，在結腸癌中，TPX2和AURKA的擴增與MYC存在相關性，且其與MYC 下游靶基因的表達呈正相關，兩者在結腸癌細胞的增殖以及惡化過程中發(fā)揮協(xié)同作用[33]。因此，MYC被認為是AURKA/TPX2 通路下游的重要基因。同時，TPX2 在細胞對缺氧的反應、腫瘤增殖特征及膠原蛋白形成等通路中也發(fā)揮重要作用。

總之，本研究通過生物信息學方法分析TPX2在HCC 中的表達及臨床意義，結果表明TPX2 可能是HCC 的一個潛在治療靶點。但是，這種分析結果還需要相應的基礎研究和臨床研究進行驗證，以便進一步明確TPX2基因在HCC 患者預后中的分子機制及臨床意義。