Polo 樣激酶1 在肝細胞肝癌中的作用及臨床意義

周 杰 李敬東 張立鑫 唐 濤

據2018 年全球癌癥統計數據［1］顯示，原發性肝癌發病率占所有癌癥發病率的第六位，由于其復雜性、異質性，轉移快，手術切除后易復發等特點占據癌癥死因的第四位。原發性肝癌包括肝細胞癌（hepatocellular carcinoma ，HCC）、肝內膽管癌以及其他罕見類型，其中HCC 占75%～85%。目前，FDA 批準的治療HCC 的小分子多靶點藥物主要有索拉非尼和侖伐替尼［2］，但兩種靶向藥物在臨床應用過程中均會出現耐藥現象，亟須找到新的治療靶點，為HCC 的序貫治療提供更多的選擇，延長患者生存期。Polo 樣激酶1（Polo-like kinase 1， PLK1）屬于Polo 樣激酶家族，多項研究證明，PLK1 在肝細胞肝癌的惡性轉化、進展中起重要作用，并提出將其作為有潛力的治療靶點［3-5］。本研究旨在探討PLK1 在肝癌細胞中的表達及其影響肝癌進展的作用途徑，并驗證其小分子抑制劑GSK461364 對肝細胞肝癌的有效性，以期找到有效的肝細胞肝癌的診療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 HepG2 細胞購買自美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC），且已進行短串聯重復序列（Short Tandem Repeat，STR） 鑒定，傳代次數20 代以內。使用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas）數據庫分析PLK1 在中mRNA 的表達，從癌癥基因組圖譜（the Cancer genome atlas，TCGA）數據集（https：//portal.gdc.com）獲得的RNAseq 數據和相應的臨床病理信息，包括肝癌患者腫瘤組織數據（369例）及肝癌患者癌旁組織數據（160 例），分析PLK1 在癌及癌旁組織樣本的基因表達差異及PLK1 表達對肝癌患者生存的影響。

1.1.2 組織 隨機選取2019 年1～6 月在川北醫學院附屬醫院肝膽外一科接受手術治療的肝癌患者30例為研究對象，包括男性21 例，女性9 例，年齡23～82歲，平均（53.1±17.0）歲。納入標準：腫瘤最大直徑>2 cm，術后石蠟病理結果確診為肝細胞肝癌。排除標準：術前接受過抗腫瘤藥物新輔助治療者；存在活動性自身免疫病者；嚴重肝腎功能障礙者（包括肝腎功能衰竭、感染者）。術中留取大小約 0.5 cm3的腫瘤及癌旁組織，儲存于液氮中。新鮮組織標本的獲取經過川北醫學院附屬醫院倫理委員會批準［倫理號：2019ER（A）067］，且于術前獲得患者知情同意并簽字。

1.1.3 試劑及抑制劑 RPMI 1640 培養基、1%左旋-谷氨酰胺（L-glutamine，L-Gln）、1% 非必需氨基酸 （non-essential amino acids，NEAA） 、1% 雙抗（鏈霉素 -青霉素，Penicillin-Streptomycin Solution，P-S）購自美國美國Gibco，逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction， RT-PCR）及實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自Takara，GSK461364 購自美國Selleck，PLK1 抗體、GAPDH 抗體、Ki-67 抗體購自CST，二抗、細胞裂解液、DAB 染色液、蘇木素、過氧化氫、山羊血清購自碧云天，小干擾RNA 購自美國sigma，CCK8 試劑盒購自日本同仁，細胞周期試劑盒購自美國BD，Trizol 購自美國Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 細胞及培養人肝癌細胞 HepG2 購自ATCC細胞庫，并經過了短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）鑒定。培養基配制：90% RPMI 1640 培養基、10%胎牛血清、1% L-Gln、1% NEAA、1% P-S，將HepG2 細胞置于含有5%CO2的37°C 培養箱中。

1.2.2 組織及細胞RNA 的提取 購買的HepG2 細胞使用0.25%EDTA 胰酶消化貼壁細胞，1 000 r/min 離心5 min，使用預冷PBS 清洗3 遍后，加入1 mL Trizol/106個細胞，室溫靜置10 min，加入1/5 體積氯仿，充分震蕩后靜置5 min 分層，12 000 r/min 離心10 min，小心吸取上層水相后加入等體積預冷異丙醇，溫和混勻室溫靜置10 min，12 000 r/min 離心10 min ，棄上清，加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀，12 000 r/min 離心10 min ，棄上清，生物安全柜中晾干，加入20～30 μL RNsase-free水，充分溶解后于-20°C 冰箱儲存。分別取100 mg 癌及癌旁組織使用預冷PBS 反復清洗，去除組織中的血細胞，吸水紙吸干后置于研缽中，加入液氮，充分研磨至無小塊，加入1 mL Trizol 靜置10 min，后續步驟同細胞RNA 提取。

1.2.3 細胞蛋白的提取 使用0.25%EDTA 胰酶消化HepG2 細胞，1 000 r/min 離心5 min，使用預冷PBS 清洗3 遍后，加入300 μL 細胞中度裂解液/106個細胞，冰上裂解30 min 后，12 000 r/min 離心15 min 取上清，使用BCA 法測定蛋白濃度后，加入蛋白loading 于金屬浴95°C 變性10 min 后，置于-20°C 冰箱待用。

1.2.4 RT-PCR 冰上配置RT-PCR 體系：5×Prime Script RT mix 2 μL、total RNA 500 ng、RNsase-free 水定容至10 μL。反應條件：37°C 15 min、85°C 5 s、4°C保存。

1.2.5 qRT-PCR 冰上配置qRT-PCR 體系：Super-Real PreMix Plus（2X）10 μL、上/下游引物（10μM）0.6 μL、cDNA 200 ng、RNsase-free 水定容至20 μL。反應條件：95°C 5 min、（95°C 10 s、63°C 5 s、72°C 1 min）39 cycles、4°C 保存。見表1。

表1 PLK1和β-Actin引物序列

1.2.6 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）瞬時轉染 將貼壁培養的HepG2 細胞消化離心后接種到6 孔板中，每組接種105個細胞，待細胞貼壁后，更換無血清培養基饑餓2 h，配置轉染試劑：①5 μLsiRNA（20 μM）+125 μL 無血清培養基；②5 μL Lipofectamine 2000+125 μL 無血清培養基，靜置5 min 后將①②體系柔和混勻，靜置20 min 后加入6 孔板中，4～6 h 更換為完全培養基。

siRNA 序 列 ， siPLK1-1 正 義 鏈 5’-GAAGAAGAUCACCCUCCUUA-3’，反 義 鏈 5’-UAAGGAGGGUGAUCUUCUUC-3’； siPLK1-2：正義鏈5'-UGAAGAAGAUCACCCUCCUUA-3' ，反義鏈 5'-UAAGGAGGGUGAUCUUCUUCA-3'。

1.2.7 Western blot 檢測蛋白表達 將提取并變性的細胞裂解液樣品加到10%電泳預制膠上樣孔中，定壓70 V，電泳30 min 后將電壓調至120 V，電泳1 h。然后將蛋白定流300 mA 1 h 轉移聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上。將膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h。封閉后，分別將裁剪后的膜與兔抗人PLK1 抗體（1∶1 000）及兔抗人GAPDH 抗體（1∶1 000）在4°C 下孵育12 h，然后與山羊兔IgG 抗體（1∶4 000）在室溫下孵育1 h。使用ECL plus 系統檢測反應，用Quantity One 軟件（Bio-Rad）分析印跡。

1.2.8 CCK8 實驗及藥物半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）檢測 將siRNA 或藥物預處理的HepG2 細胞接種到96 孔板中，每組設置三個復孔，孵育6 h 以允許表面粘附。 每孔加入10 μL CCK8 孵育2 h 后檢測0 h、24 h、48 h、72 h、96 h 吸光度評估生存力。測定IC50 每孔接種5 000 個細胞，細胞增殖實驗，每孔接種1 000 個細胞。

1.2.9 平板克隆實驗檢測細胞增殖 將siRNA 或藥物預處理的HepG2 細胞接種到6 孔板中，每組接種1 000 個細胞，設置3 個復孔，14 d 后收獲細胞，使用預冷PBS 清洗，4% 多聚甲醛固定，結晶紫染色后拍照并計數。

1.2.10 細胞周期檢測 將siRNA 或藥物預處理的HepG2 細胞接種到6 孔板中，24 h 后用胰酶收獲細胞至流式管，預冷PBS 清洗細胞三遍，在每個流式管中加入 500 μL PBS 含 5 μg/mL 碘化丙啶、100 μg/mL RNAseA、0.2%TritonX-100， 4℃避光孵育30 min，24 h 內上流式機檢測。

1.2.11 動物模型的構建 使用HepG2 細胞構建裸鼠皮下成瘤模型，每只裸鼠注射5×105個細胞，于SPF 級環境下喂養2 周后，腫瘤體積生長至為0.5×0.5 cm2時，按照裸鼠體質量大小進行編號排序分為3 組，每組采取隨機分配法分別納入生理鹽水注射組及GSK461364 注射組，每組3 只，分別給予生理鹽水腹腔注射，及50 mg/kg GSK461364 腹腔注射，注射頻率為4天一次，同時每隔4 天測量一次腫瘤大小及小鼠體質量，20 d 后收獲皮下腫瘤。

1.2.12 免疫組織化學染色 解剖動物腫瘤組織使用生理鹽水反復清洗，浸入10%的福爾馬林固定12～24 h 后進行包埋切片。組織切片于70℃烤箱中融蠟2 h，分別在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液中浸泡30 min，無水乙醇、95% 乙醇、85% 乙醇、75% 乙醇中浸泡5 min 脫蠟，使用枸櫞酸鹽進行高壓修復后，山羊血清10 min 及3%的過氧化氫30 min 封閉后，孵育Ki-67 一抗，4℃過夜。轉天孵育二抗后進行DAB 染色、蘇木素復染及梯度乙醇和二甲苯脫水處理后，晾干封片，于顯微鏡下觀察、拍照。

1.3 分組情況 ①小干擾處理HepG2 細胞分為siCtrl組、siPLK1-1 組、siPLKI-2 組；②小分子抑制劑處理HepG2 細胞分為DMSO 組、GSK461364 組；③動物體內實驗分為生理鹽水注射組、GSK461364 注射組。

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0 進行數據整理與分析，計量資料使用表示，兩組間差異進行獨立樣本t檢驗，多組間兩兩比較進行ANOVA 單因素方差分析；不符合正態分布的計量資料采用M（P25，P75）表示，采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以例或率表示，采用χ2檢驗，根據TCGA 數據庫對患者的無病生存期（disease free survival，DFS）進行log-rank 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PLK1 在肝癌中的表達及臨床意義 使用TCGA（The Cancer Genome Atlas）數據庫分析PLK1 在肝癌組織（369 例）及癌旁組織（160 例）中mRNA 的表達，結果顯示，PLK1 在肝癌中的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。生存分析顯示，PLK1高表達者（以基因表達的中位數為表達分界閾值）的DFS 明顯低于PLK1 低表達者（P＜0.05）。為進一步驗證，提取我院30 例肝細胞肝癌患者的腫瘤組織及癌旁組織分析PLK1 mRNA 表達，結果顯示，PLK1 在腫瘤組織的表達明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.001）。見表2、圖1。

圖1 PLK1表達與肝細胞肝癌患者預后的生存分析分析

表2 PLK1在TCGA數據庫及臨床樣本肝癌中的mRNA表達差異

2.2 3 組siRNA 敲低HepG2 細胞增殖情況比較 使用siRNA 敲低HepG2 細胞中PLK1 的表達，結果顯示兩對siRNA 對PLK1 的敲低效率分別為（71.3±4.8）%、（65.3±5.3）%［與對照組相比，相對灰度值分別為（0.2±0.2）比（1.0±0.2），t1=14.752，P<0.001；（0.4±0.2）比（1.0±0.2），t2=9.771，P<0.001］（圖2A），與siCtrl 組相比，siPLK1-1、siPLK1-2 組肝癌細胞HpG2 增殖能力明顯降低［CCK8 實驗中96 h 的細胞相對活力為［（4.4±0.2）比（9.8±0.2），t1=33.068，P<0.001；（4.8±0.2）比（9.8±0.2），t2=30.619，P<0.001］。平板克隆實驗中細胞克隆數差異有統計學意義為［（20.8±4.3）比（201.5±8.9），t1=31.664，P<0.001；（28.6±5.0）比（201.5±8.9），t2=29.336，P<0.001］（圖2B）周期實驗結果顯示，與siCtrl 組相比，siPLK1 組的HpG2 細胞周期阻滯在G2 期［細胞G2 期比例為（37.2±1.7）%比（13.6±1.2）%，t1=19.644，P<0.001；（36.5±1.9）%比（13.6±1.21）% ，t2=17.001，P<0.001］（ 圖 2C）。見表3。

圖2 siRNA敲低PLK1抑制肝癌細胞增殖

表3 敲低PLK1對肝癌細胞的增殖抑制作用比較

2.3 DMSO 組與GSK461364 組肝癌細胞增殖情況比較 隨后使用PLK1 特異性小分子抑制劑GSK461364處理HepG2 細胞，測定IC50=24.960 nM，選用25 nM濃度，分別進行CCK8、平板克隆及細胞周期實驗，結果顯示，與DMSO 組相比，GSK461364 組細胞相對活力明顯降低（P＜0.001）。細胞克隆數明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.001）（圖3A），細胞周期阻滯在G2 期，與siRNA 處理后實驗結果一致，差異有統計學意義（P＜0.001）（圖3B），GSK461364 可有效抑制肝癌細胞系HepG2 的增殖，差異有統計學意義。見表4。

圖3 PLK1小分子抑制劑GSK461364抑制肝癌細胞增殖

表4 GSK461364抑制肝癌細胞增殖能力情況

2.4 生理鹽水注射組與GSK461364 注射組抑制HepG2 移植瘤增殖情況比較 使用HepG2 細胞構建裸鼠皮下成瘤模型進行體內給藥處理，結果顯示相對于生理鹽水注射組，GSK461364 注射組的肝癌生長速度明顯減慢（P<0.001）；Ki-67 染色陽性率明顯降低（P<0.001）。見圖4、表5。

圖4 PLK1小分子抑制劑GSK461364在動物體內抑制肝細胞肝癌進展

表5 GSK461364在動物體內抑制肝細胞肝癌進展能力情況

3 討論

HCC 患者就診斷時通常已處于晚期階段，死亡率極高，是癌癥相關死亡率的第二大誘因［6-8］。癌細胞的惡性增殖受多種信號通路的調控，靶向癌細胞不可控制的有絲分裂過程關鍵成分是抑制其進展最重要的治療方法之一，尤其是靶向關鍵有絲分裂激酶的新型抗有絲分裂劑的開發，具有抗擊HCC 的巨大潛力［9］。PLK1 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，廣泛存在于真核細胞中，已被確定是細胞周期進程，尤其是有絲分裂的關鍵調節劑，在細胞周期調控中起著關鍵作用，被認為是HCC 中有希望的靶標。

作為PLK 家族的成員，PLK1 蛋白主要分為三個功能不同的結構域：高度保守的N 末端激酶催化結構域（APT 結合區和T-loop 區），C 末端polo-box 結構域以及中間的連接區域。PLK1 蛋白可以通過polo-box 結構域與某些蛋白的磷酸肽結合。在正常情況下，polobox 結構域總是與N 末端激酶結構域結合，以抑制激酶中T210 的磷酸化，從而抑制PLK1 的激酶活性。當polo-box 結構域與不同的磷酸肽相互作用而募集到特定的細胞位置時，其激酶結構域被釋放，PLK1 被激活，磷酸化不同的蛋白質或同一蛋白質的不同位點［10］，調節發育、細胞有絲分裂及DNA 損傷應答等過程。PLK1在多種類型的腫瘤細胞中異常表達［11-14］，并且PLK1 水平升高與腫瘤發生和不良的臨床預后密切相關。多項研究顯示，PLK1 的過表達與轉移性HCC 疾病和HCC預后不良有關［5，15-17］。本項研究中，在大多數HCC 患者中發現了PLK1 基因的過表達，這表明PLK1 可能在HCC 的腫瘤發生中起作用；生存分析顯示，PLK1 的高表達與更低的HCC 總體生存率相關，表明PLK1 同時可能在HCC 的發展中起重要作用，是HCC 診斷及預后的潛在靶點之一。另一方面本研究體外CCK8、平板克隆結果顯示，敲低PLK1 蛋白表達，HepG2 細胞增殖速度明顯減慢。PLK1 在細胞周期的G2 期后期被激活，是進入有絲分裂所必需的［18］，本研究流式細胞學結果顯示，敲低PLK1 后，細胞周期阻滯在G2/M 期，驗證了PLK1 可促進肝癌細胞增殖。因此， PLK1 可被認為是HCC 潛在治療靶點之一。

GSK461364 是可逆的ATP 競爭性的PLK1 選擇性抑制劑， 對PLK1 的選擇性比對PLK2 和PLK3 的選擇性高至少390 倍，抑制PLK1 會導致細胞中有絲分裂延遲延長，有絲分裂異常退出和p53 活化，相對其他抑制劑治療時產生的毒性相關副作用更少，在乳腺癌、神經系統腫瘤等多種腫瘤中已得到應用［19-20］。本研究體外使用PLK1 小分子抑制劑GSK461364 處理HepG2 細胞，檢測藥物IC50=24.96 nM，表明肝癌細胞對GSK461364 具有較高的敏感性，低劑量即可產生明顯的抑制作用，CCK8、平板克隆結果顯示，GSK461364 可有效抑制HCC 細胞增殖，誘導細胞發生G2 / M 阻滯，抑制肝癌進展。本研究證明PLK1 在肝細胞肝癌中的促癌作用，將其預測為治療的潛在靶點，但存在一定的局限性。首先，目前對于PLK1 在肝細胞肝癌中表達升高的調控機制，以及PLK1 誘導肝細胞肝癌進展的下游通路仍無明確報道，有待進一步尋找并驗證。其次，GSK461364 目前僅完成了淋巴瘤的臨床試驗，在肝癌中的大規模臨床試驗仍未開展，但本研究中的體內給藥療效為該肝細胞肝癌惡性進展相關靶點抑制劑的臨床轉化提供了良好的實驗室基礎。

綜上所述，PLK1 在大多數肝癌患者中高表達，與肝癌的發生、發展及不良預后密切相關，是潛在的診療靶點，其小分子抑制劑GSK461364 在動物體內的應用可有效降低肝細胞肝癌的惡性程度，抑制腫瘤進展，可作為有效的治療策略之一，具有良好的臨床轉化前景。