川崎病患兒外周血LncRNA SNHG5 miR-132 的差異表達及臨床意義

沈 韜 張海濤 顧旭華 金 律

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種好發于5 歲以下嬰幼兒及兒童的自身免疫性疾病，以全身性中小血管炎為主要病理特征［1］。冠狀動脈是KD 最常見的受累血管，KD 導致的冠狀動脈病變（coronary artery lesion，CAL）是患兒死亡的首要原因，也是目前兒童后天性心臟病的主要病因［2-3］。在臨床實踐中，KD 的早診斷、早治療對減少CAL 的發生具有重要意義，但目前KD 的診斷主要依靠臨床癥狀，缺乏特異性實驗室指標。因此，尋找KD 特異性的診斷標志物是KD 相關研究的熱點之一。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miR）是在體內發揮復雜生物學作用的非編碼RNA，lncRNA 能夠吸附miR 并抑制miR 對下游靶基因的調控作用，lncRNA 靶向miR 不僅是多種疾病發病機制的研究靶點，異常表達的lncRNA及miR 也能釋放進入血液循環并成為診斷疾病、評估病情的標志物。一項KD 相關的臨床研究通過基因芯片技術證實，KD 患兒外周血中存在LncRNA LINC00999-miR-6780 軸、LncRNA PSORS1C3-miR-216a 軸、LncRNA SNHG5-miR-132/miR-92 軸表達的變化［4］。目前，lncRNAs 及miRs 用于KD 診斷及病情評估尚缺乏足夠的臨床研究證據。因此，本研究將通過熒光定量PCR 的技術對KD 患兒外周血中上述幾種lncRNAs 及miRs 表達的變化進行驗證，旨在篩選能夠用于KD 診斷及病情評估的標志物，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016 年1 月至2020 年12 月在蘇州市中西醫結合醫院兒科確診的62 例KD 患兒作為研究的KD 組，納入標準：①結合病史、癥狀體征、輔助檢查，符合診斷與治療專家共識［5］中KD 的診斷標準；②未接受過KD 的治療；③按lncRNAs、miRs 表達的檢測，在入組后當天或次日要求留取空腹外周靜脈血；④臨床資料完整；⑤入組后當天或次日進行心超檢查。排除標準：①合并現癥感染的患兒；②伴有其他心血管系統疾病；③合并先天性畸形、遺傳代謝病；④接受過丙種球蛋白、阿司匹林等治療。另取同期在我院進行健康體檢的80 例健康兒童作為對照組。KD 組中男性39 例、女性23 例，年齡10 個月～7 歲、平均（3.31±0.62）歲；出生周齡36～41 周，平均（38.92±7.39）周；對照組中男性48 例、女性32 例，年齡1～8 歲、平均（3.52±0.77）歲，出生周齡36～41 周，平均（38.44±7.62）周。兩組對象一般資料的比較，差異無統計學意義（P>0.05）。本研究獲得醫院倫理委員會批準后實施（倫理號：2016 倫審批第002 號）。

1.2 外周血lncRNAs、miRs 表達水平的檢測 KD 組患兒入組后晨起空腹時采集外周靜脈血5 mL，對照組兒童體檢時采集空腹外周靜脈血5 mL，采用血液RNA提取試劑盒（貨號：19241ES50，上海翌圣生物科技公司）提取外周靜脈血的總RNA，采用lncRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號：KR202，北京天根生化科技公司）對RNA 進行反轉錄得到lncRNA cDNA，miR cDNA第一鏈合成試劑盒（貨號：KR201，北京天根生化科技公司）對RNA 進行反轉錄得到miR cDNA，cDNA 放置在-20℃保存。

取cDNA 進行熒光定量PCR 檢測。采用lncRNA熒光定量檢測試劑盒（貨號：FP402，北京天根生化科技公司）對lncRNA 進行檢測，采用miR 熒光定量檢測試劑盒（貨號：FP401，北京天根生化科技公司），反應體系：cDNA 10 ng、預混液 10 μL、10 μmol/L 的正向引物（序列5’-TATCGTATGCTAGCTAGCT-3’）和反向引物（5’-TATGCGTAGGTAGCTAGCT-3’）各0.5 μL、去離子水補足至20 μL；反應程序：95℃預變性15 min，94℃20 s、60℃ 34 s、重復40 個循環，得到反應的循環曲線及循環閾值（Ct），以U6 為內參、按照公式2-△△Ct計算LncRNA LINC00999、miR-6780、LncRNA PSORS1C3、miR-216a、LncRNA SNHG5、miR-132、miR-92 的表達水平。

1.3 實驗室指標的檢測 KD 組患兒入組后晨起空腹時采集外周靜脈血，對照組兒童體檢時采集空腹外周靜脈血，采用血常規儀檢測白細胞計數（white blood cell，WBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HB）、血小板計數（platelet，PLT），采用紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）測定儀檢測ESR，采用全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、肌酐（creatinine，Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、C 反應蛋白（C-reactive protein ，CRP）。

1.4 CAL 的評估 參照《川崎病冠狀動脈病變的臨床處理建議》［6］，采用彩色多普勒超聲診斷儀對KD 患兒進行超聲心動圖檢查，對左冠狀動脈主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈及后降支冠狀動脈進行掃查，出現冠狀動脈擴張、狹窄或冠狀動脈瘤等超聲表現判斷為CAL。根據評估結果將KD 患兒分為CAL 組和無CAL（non-CAL，NCAL）組。

1.5 統計學方法 采用SPSS21.0 軟件錄入數據，計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Pearson 檢驗。分別以《兒童風濕性疾病相關巨噬細胞活化綜合征診斷與治療專家共識之五--川崎病篇》中KD 的診斷標準和《川崎病冠狀動脈病變的臨床處理建議》中KD 合并CAL 的診斷標準為金標準，采用Prism 軟件通過繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線對LncRNA SNHG5、miR-132 診斷KD 及KD 合并CAL 的效能進行探討。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組對象外周血lncRNAs 及miRs 表達水平的比較 KD 組外周血中LncRNA SNHG5 的表達水平高于對照組，miR-132 的表達水平低于對照組（均P<0.05）；兩組外周血中LncRNA LINC00999、LncRNA PSORS1C3、miR-6780、miR-216a、miR-92 的表達水平比較均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 KD組與對照組外周血lncRNAs及miRs表達水平的比較

2.2 KD 組中LncRNA SNHG5、miR-132表達水平的相關性 KD 組患兒外周血中LncRNA SNHG5 的表達水平與miR-132 的表達水平呈負相關（r=-0.527，P<0.001）。

2.3 LncRNA SNHG5、miR-132表達水平對KD 的診斷價值 以專家共識中KD 的診斷標準作為金標準，分析外周血LncRNA SNHG5、miR-132 表達水平對KD 的診斷價值。在Prism 軟件中錄入數據并進行定義，1 定義為符合KD 診斷、0 定義為健康兒童，得到ROC 曲線見圖2，兩項指標均對KD 具有診斷價值，見表2。

圖1 KD 組中LncRNA SNHG5、miR-132 表達水平相關性的散點圖

表2 外周血LncRNA SNHG5、miR-132表達水平診斷KD的效能

2.4 KD 組中LncRNA SNHG5、miR-132表達水平與實驗室指標的相關性 KD 組中LncRNA SNHG5 的表達水平與CRP、ESR 呈正相關，miR-132 的表達水平與CRP、ESR 呈負相關（P<0.05）；LncRNA SNHG5、miR-132 表達水平與WBC、HB、PLT、ALT、AST、TC、TG、Cr、BUN 無相關性（P>0.05）。見表3。

表3 KD組中LncRNA SNHG5、miR-132表達水平與實驗室指標的相關性

2.5 KD 組中CAL 與NCAL 患兒LncRNA SNHG5、miR-132 表達水平的比較 KD 組CAL 患兒外周血中LncRNA SNHG5 的表達水平高于NCAL 患兒，miR-132的表達水平低于NCAL 患兒，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

表4 KD組中CAL與NCAL患兒LncRNA SNHG5、miR-132表達水平的比較

2.6 LncRNA SNHG5、miR-132 表達水平對KD 患兒CAL 的診斷價值 參照《川崎病冠狀動脈病變的臨床處理建議》［6］中CAL 的標準作為金標準，分析外周血LncRNA SNHG5、miR-132 表達水平對KD 患兒CAL的診斷價值。在Prism 軟件中錄入數據并進行定義，1定義為符合CAL 診斷、0 定義為不符合CAL 診斷，得到ROC 曲線見圖3，兩項指標均對KD 患兒CAL 具有診斷價值，診斷效能見表5。

圖3 外周血LncRNA SNHG5、miR-132表達水平診斷KD患兒CAL的ROC曲線

表5 外周血LncRNA SNHG5、miR-132表達水平診斷KD患兒CAL的效能

3 討論

KD 是一類急性發熱性出疹性疾病，以全身免疫系統活化及血管內皮系統損害為特征，可累及動靜脈及毛細血管并造成心血管系統并發癥［7-8］。KD 的發病機制至今仍不十分明確，雖然在急性期會出現WBC、CRP、ESR 等指標升高，但上述指標用于KD 診斷的缺乏特異性，目前臨床上診斷KD 仍主要依靠臨床表現，不典型病例容易出現誤診漏診。因此，尋找KD 診斷標志物具有迫切的臨床需求。

LncRNAs 及miRs 是參與基因表達轉錄后調控的非編碼RNA，LncRNAs 能夠通過類似“分子海綿”的作用吸附miRs、抑制miRs 對下游靶基因的負性調控作用，最終形成lncRNA-miR-靶基因軸并在不同疾病的病理生理過程中發揮生物學作用。同時，在疾病發病過程中異常表達的lncRNAs 及miRs 會造成外周循環中相應分子表達的變化，進而可以作用診斷疾病及評估病情的標志物［9-12］。本研究在Guo 等的研究基礎上對KD 患兒外周血中LncRNA LINC00999-miR-6780軸 、LncRNA PSORS1C3-miR-216a 軸 、LncRNA SNHG5-miR-132/miR-92 軸的表達進行了熒光定量PCR 的驗證，lncRNAs 及miRs 表達變化的趨勢與微陣列數據庫分析的結果吻合，但只有LncRNA SNHG5 及miR-132 表達水平在KD 患兒與健康兒童的比較中有統計學差異，因此本文將繼續探索LncRNA SNHG5 及miR-132 在KD 發病中的作用。

已有國內外相關的臨床研究使用外周血LncRNA SNHG5 及miR-132 疾病的診斷，包括LncRNA SNHG5用于胃癌［13］、非小細胞肺癌［14］的診斷及miR-132 用于膿毒癥心肌病［15］、動脈粥樣硬化［16］、非酒精性脂肪肝［17］的診斷。基于KD 患兒外周血中LncRNA SNHG5 及miR-132 表達的微陣列檢測結果及熒光定量PCR 檢測結果，本研究將上述兩種分子用于KD 的診斷，經ROC曲線分析證實外周血LncRNA SNHG5 及miR-132 均對KD 具有診斷價值，且診斷效能理想、LncRNA SNHG5 診斷的靈敏性和特異性均超過85%，通過擴大研究的樣本量可能有助于找到LncRNA SNHG5 診斷KD 更理想的截斷值，進而提高診斷的靈敏度和特異性。

LncRNA SNHG5 對miR-132 具有靶向調控作用，相關研究分別在慢性阻塞性肺疾病、結直腸癌、宮頸癌模型中證實，LncRNA SNHG5 與miR-132 具有靶向調控關系［18-20］。本研究在KD 患兒中通過相關性分析證實：LncRNA SNHG5 與miR-132 的表達具有負相關關系，提示在KD 的發病過程中LncRNA SNHG5 可能靶向miR-132 并發揮作用。目前關于miR-132 生物學作用的研究認為靶向PTEN、NF-κB、p38/JNK 等促炎、促凋亡基因是其主要的生物學效應，高表達的miR-132 能夠通過抗炎、抗凋亡作用減輕不同病理因素引起的內皮細胞損傷［18，21-23］。廣泛的血管內皮系統損害是KD 的重要特征，本研究已經發現KD 患兒外周血中LncRNA SNHG5 表達增加及miR-132 表達降低且具有負相關的結果提示高表達的LncRNA SNHG5 可能通過抑制miR-132、削弱其抗炎及抗凋亡作用，進而造成KD 的發病。基于此推測，本研究收集了KD 患兒的實驗室指標并進行相關性分析，結果顯示：LncRNA SNHG5 與CRP、ESR 呈正相關，miR-132 與CRP、ESR呈負相關。CRP 和ESR 是評價KD 病情的非特異性指標，水平升高反映了病情活動及炎癥激活，上述相關性分析的結果提示LncRNA SNHG5 及miR-132 表達的變化與KD 病情的進展相關。

全身性中小血管炎是KD 主要的病理特征，其中CAL 是KD 最常見的血管并發癥，也是影響預后、增加心血管疾病發生風險的主要原因。在KD 的早診斷、早治療中，準確評估CAL 是重要一環。超聲心動圖是目前評估KD 患兒的CAL 的主要輔助檢查手段［24-25］，但因為患兒年齡較小、對檢查的配合度較低，部分患兒需要使用基礎麻醉才能完成檢查，使得該項檢查在KD 患兒中的應用受到限制。本研究使用LncRNA SNHG5 及miR-132 作為標志物進行KD 患兒CAL 的診斷，與NCAL 的KD 患兒比較，合并CAL 的KD 患兒外周血LncRNA SNHG5 表達水平增加、miR-132 表達水平降低，且兩項標志物均對KD 患兒的CAL 具有診斷價值，雖然診斷的靈敏性和特異性均不足80%，但仍然可以為今后使用LncRNA SNHG5、miR-132 兩項標志物進行KD 合并CAL 的診斷提供依據。

綜上所述，在KD 的發病過程中存在多種lncRNAs及miRs 表達的變化，其中LncRNA SNHG5 表達水平顯著增加、miR-132 表達水平顯著降低且具有負相關關系；LncRNA SNHG5 和miR-132 不僅對KD 具有診斷價值，還對KD 合并CAL 具有診斷價值，是未來用于診斷KD 及KD 合并CAL 的潛在標志物。同時，KD 患兒LncRNA SNHG5 及miR-132 的表達水平還與CRP、ESR 存在相關性，提示LncRNA SNHG5/miR-132 軸的變化與KD 病情活動及炎癥激活有關，這也為今后研究KD 的發病機制提供了新思路。