結直腸癌CD146基因甲基化與患者臨床病理特征和生存的關系

陳金明，楊關根，裘建明，王東，秦靚，沈忠

結直腸癌CD146基因甲基化與患者臨床病理特征和生存的關系

陳金明，楊關根，裘建明，王東，秦靚，沈忠

浙江省杭州市第三人民醫院肛腸科，浙江杭州 310009

探討結直腸癌組織中CD146基因甲基化改變與患者臨床病理特征和生存的關系。應用甲基化特異性聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法，分析CD146基因甲基化。采用電化學發光法進行定量檢測結直腸癌患者血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）含量。采用Kaplan-Meier生存曲線計算結直腸癌患者生存率。與結直腸癌組相比，對照組和腺瘤組CD146基因甲基化陽性率差異有統計學意義（<0.05）。CD146基因甲基化與結直腸癌患者淋巴結轉移、浸潤深度和TNM分期之間，差異有統計學意義（<0.05）。CD146基因甲基化與CEA含量之間明顯相關（<0.05）。Kaplan-Meier生存曲線經Log-rank檢驗發現，CD146基因甲基化與結直腸癌患者總體5年生存率之間存在相關性（<0.05）。CD146基因表觀遺傳學的改變參與了結直腸癌的發生、發展。檢測CD146基因甲基化可作為反映結直腸癌患者部分惡性生物學行為和生存期的指標。

結直腸癌；CD146；基因；甲基化；生存

CD146是一種在血管內皮細胞表達的黏附分子，通過結合不同配體的信號轉導通路發揮關鍵作用。CD146參與了血管新生、脈管的滲漏和白細胞的遷移[1]。在多種惡性腫瘤中均發現CD146過表達，它參與了腫瘤生成和進展的各個環節，尤其與腫瘤血管新生和淋巴管的轉移密切相關[2]。DNA甲基化是常見的表觀遺傳學改變。在結直腸癌發生、發展過程中，CD146基因表觀遺傳學的改變，以及與結直腸癌患者臨床病理特征和生存的關系，在文獻中尚未見報道。本研究旨在探討CD146基因甲基化的改變與結直腸癌患者臨床病理特征和患者生存的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集杭州市第三人民醫院2015年1月至2016年6月外科手術切除并有完整隨訪資料的結直腸癌組織標本68例。納入標準：①經組織病理學檢查診斷為結直腸癌；②首次行結直腸癌根治性切除術，術前未行放化療；③患者或家屬隨訪依從性好。排除標準：①合并其他臟器惡性腫瘤；②術前已接受放、化療治療；③合并嚴重心臟、肺、肝臟、腎臟等基礎疾病；④無法配合隨訪。68例結直腸癌患者中，男37例，女31例，年齡26～80歲，平均年齡為（57.39±14.58）歲。選取同期手術切除和結腸鏡下摘除結直腸腺瘤的患者26例，其中男15例，女11例，年齡30～73歲，平均年齡為（54.85±11.90）歲。另收集正常結直腸黏膜標本15例作為對照組。隨訪方式采用郵件、電話和門診隨訪，隨訪截止日期為2021年6月30日。總生存時間（overall survival，OS）定義為手術后第1天至患者死亡日期或截止日期。至隨訪截止日期，68例隨訪患者中，29例患者死亡。同時收集所有入組患者的癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平。本研究經浙江省杭州市第三人民醫院倫理委員會審批（倫理審批號：Y-KL2020008、Y-KL2020009），所有入選患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 甲基化特異性PCR檢測

CD146在啟動子區的甲基化狀況：采用酚氯仿抽提，乙醇沉淀法提取組織DNA，用ddH2O溶解，紫外分光光度計測定其濃度及純度，置于–20℃冰箱保存。取2μg的DNA標本用亞硫酸氫鹽處理，然后經DNA Wizard純化回收試劑盒（美國Promega公司）純化回收DNA，所得修飾后DNA作為甲基化特異性PCR擴增的模板（立即使用或–20℃保存）。分別設計CD146特異性甲基化引物（CD146-M）和特異性非甲基化引物（CD146-U），引物序列：①CD146-M上游引物：5’-ATTATATTTAGGTGGGAAGTGCGT-3’，下游引物：5’-CTACGAACCATACAAAAACAACGTA-3’，產物為105bp；②CD146-U上游引物：5’-GGGATTAT ATTTAGGTGGGAAGTGT-3’，下游引物：5’-CTACA AACCATACAAAAACAACAT A-3’，產物為108bp。對亞硫酸鹽修飾后的DNA樣品進行PCR擴增，反應條件為：95℃ 5min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s，35個循環；72℃ 7min。以體外高甲基化DNA（in vitro hypermethylated DNA，IVD）為甲基化陽性對照，用純化的人類HCT 116 DKO非甲基化DNA作為非甲基化對照，以去離子水為空白對照，見圖1。

圖1 CD146基因甲基化在結直腸組織中的表達

注：U為非甲基化；M為甲基化

1.3 甲基化特異性PCR產物分析與癌胚抗原檢測

取10μl PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳，130V約20min。判斷標準：若CD146-M引物擴增出105bp條帶，而CD146-U引物未擴增出條帶，說明CD146基因啟動子區發生了完全甲基化；若CD146-M引物未擴增出條帶，而CD146-U引物擴增出108bp條帶，說明未發生甲基化；如果兩種引物均擴增出相應大小的條帶，說明存在部分甲基化。部分甲基化和完全甲基化均視為甲基化。采用電化學發光法進行定量檢測，≥5ng/ml為陽性，<5ng/ml為陰性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行處理分析。結直腸癌細胞CD146基因甲基化與患者臨床病理參數的關系分析采用2檢驗；結直腸癌細胞CD146基因甲基化與患者CEA之間的相互關系采用Pearson相關性分析。結直腸癌細胞CD146基因甲基化與患者術后生存的關系分析采用Kaplan-Meier限乘法計算生存率，繪制累積生存函數曲線，采用Log-rank法進行差異顯著性檢驗。<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD146基因甲基化在結直腸各組織中的陽性率比較

15例對照組發生CD146基因甲基化2例，甲基化陽性率為13.33%。26例腺瘤發生CD146基因甲基化6例，甲基化陽性率為23.08%。其中低級別腺瘤為12例，發生甲基化2例，甲基化陽性率為16.67%；高級別腺瘤為14例，發生甲基化4例，甲基化陽性率為28.57%。68例結直腸癌發生CD146基因甲基化46例，甲基化陽性率為67.65%。與結直腸癌組相比，對照組、低級別和高級別腺瘤組CD146基因甲基化陽性率差異均有統計學意義（2=24.435，0.05）。

2.2 結直腸癌組織中CD146基因甲基化與患者臨床病理特征的關系

CD146基因甲基化與患者的性別、年齡、腫瘤直徑和部位、分化程度之間，差異均無統計學意義（>0.05）。但與淋巴結轉移、浸潤深度和TNM分期之間，差異有統計學意義（<0.05）。

表1 CD146基因甲基化與結直腸癌患者臨床病理特征的關系[n（%）]

2.3 結直腸癌組織CD146基因甲基化與CEA、患者生存的關系

在68例結直腸癌患者中，CEA陽性38例，陽性率為55.88%。結直腸癌組織CD146基因甲基化與CEA的相互關系，經Pearson相關性分析顯示，結直腸癌組織CD146基因甲基化與CEA之間呈正相關。（=0.272，0.025）。結直腸癌患者CD146基因甲基化組和未甲基化組Kaplan-Meier生存曲線經Log-rank檢驗統計量的值為3.92，差異有統計學意義（<0.05），見圖2。

圖2 CD146基因甲基化與結直腸癌患者5年生存率的關系

3 討論

結直腸癌的進展是一個復雜的、涉及遺傳和表觀遺傳學改變的多步驟累積的過程。在結腸上皮、腺瘤和腸癌的演變過程中，伴隨著一定數量和分布的驅動基因的突變以及表觀遺傳學的改變[3]。上述的演變使得腫瘤細胞能結合各種不同的功能蛋白，導致腫瘤細胞適應能力的提高并通過達爾文式的自然選擇造成治療失敗[4]。本研究旨在探討結直腸癌發生、進展過程中，CD146基因甲基化表觀遺傳學改變的變化特點，以及與患者臨床病理學特征、血清CEA和患者生存的關系，從而初步揭示CD146基因甲基化表觀遺傳學調控網絡的紊亂在結直腸癌發生和進展過程中的變化特征和預后價值。

在本研究中，對照組、腺瘤組和結直腸癌組中，CD146基因甲基化陽性率分別為13.33%、23.08%和67.65%。對照組、低級別和高級別腺瘤組之間，CD146基因甲基化陽性率差異無統計學意義（>0.05）。對照組、腺瘤組與結直腸癌組之間，CD146基因甲基化陽性率差異有統計學意義（<0.05）。表明在結直腸癌的發生、進展過程中，CD146基因發生了高甲基化，導致CD146基因表達降低。在已發表的人類的部分實體腫瘤研究中，也發現了CD146基因高甲基化現象。在前列腺癌的研究中，發現非瘤變前列腺組織、前列腺上皮內瘤變和前列腺原位癌中CD146基因甲基化率分別為12.5%、23.0%和80.0%。前列腺癌中CD146基因啟動子區發生了高甲基化[5]。在結直腸癌中，通過激活Wnt/β-catenin信號通路，降低CD146基因表達促進了腫瘤形成和癌的干性[6]。在乳腺癌的進展中，異常的啟動子區甲基化抑制了CD146基因表達[7]。

結直腸癌組織中CD146基因甲基化與結直腸癌患者臨床病理特征的關系研究結果顯示，CD146基因甲基化與患者的性別、年齡、腫瘤直徑和部位、分化程度之間，差異無統計學意義（>0.05）。但與淋巴結轉移、浸潤深度和TNM分期之間，差異有統計學意義（<0.05）。在前列腺癌的研究中，發現CD146基因甲基化與Gleason分級和腫瘤分期密切相關[5]。

本研究結果表明CD146基因甲基化與CEA之間相關程度較弱。在早期前列腺癌的血清中，發現CD146基因甲基化，能作為潛在的生物學標志物[8]。結直腸癌組織中CD146基因甲基化在腫瘤早期和晚期均有表達，而CEA大部分在結直腸癌晚期患者血清中檢測水平較高，這可能是造成兩者之間弱相關的原因之一。

本研究中CD146基因甲基化與未甲基化組相比，預后較差。在透明細胞性腎細胞癌的研究中發現，CD146基因甲基化率低于正常組織，CD146基因高表達與不良預后相關[9]。而在本研究中發現，結直腸癌中CD146基因甲基化率明顯高于正常組織，并且與不良預后有關。這可能表明不同類型的實體腫瘤表觀遺傳學特性明顯不同。另外，在不同類型的腫瘤中，可能CD146基因與不同的配體結合發揮了不同的生物學功能。結直腸癌的表觀遺傳學圖譜包括成百上千的異常甲基化基因和幾十種異常的miRNAs[10]。同時，胃腸道組織表觀遺傳學改變作為敏感生物學標志物可用于消化道腫瘤的檢測[11]。

綜上所述，CD146基因表觀遺傳學的改變參與了結直腸癌的發生、進展，檢測CD146基因甲基化可作為反映結直腸癌患者部分惡性生物學行為和生存期的指標。另外，本研究患者樣本量較少，也未同步檢測血漿CD146基因甲基化在結直腸癌演進中的變化特點，今后需要在增加樣本量的基礎上，對CD146基因甲基化在結直腸癌演進中的臨床應用價值進行更進一步的深入探討。

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Relationship between CD146 gene methylation, clinicopathological features, and survival in colorectal cancer

Department of Anorectal Surgery, the Third Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310009, Zhejiang, China

To investigate the relationship between CD146 gene methylation, clinico-pathological features, and survival of patients with colorectal cancer.The expression of CD146 promoter methylation were detected by methylation-specific polymerase chain reaction. The content of serum carcinoembryonic antigen (CEA) in patients with colorectal cancer was quantitatively detected by electrochemiluminescence. The survival rate of patients with colorectal cancer was evaluated by Kaplan-Meier survival curves.Compared with the colorectal cancer group, the methylation positive rate of CD146 gene promoter methylation of control group and adenoma group were significantly different (<0.05). There were significant differences between CD146 gene promoter methylation and lymph node metastasis, tumor infiltrating depth, TNM stage (<0.05). There was significant correlation between CD146 gene promoter methylation and CEA content (<0.05). Kaplan-Meier survival curves tested by Log-rank test showedthat there was correlation between CD146 gene promoter methylation and 5-year overall survival rate (<0.05).CD146 gene epigenetic alteration may be related with the occurrence and development of colorectal cancer. The detection for CD146 gene promoter methylation may be helpful to evaluate partial malignant biological behavior and survival of patients with colorectal cancer.

Colorectal cancer; CD146; Gene; Methylation; Survival

R735

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.29.009

杭州市衛生科技計劃項目（A20200024）；杭州市科技發展計劃項目（20201203B201）

沈忠，電子信箱：shenzhong114@sina.com

（2022–12–11）

（2023–09–04）