微弧氧化涂層促進3D打印個性化鈦種植體骨愈合的體內實驗研究

徐延，于晴，房睿，閻旭，叢芳，王文茉，張桂榮

（1. 沈陽市口腔醫(yī)院綜合門診，沈陽 110002； 2. 中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院·附屬口腔醫(yī)院干診科，沈陽 110002； 3. 沈陽市口腔醫(yī)院科教科，沈陽 110002）

種植體與其周圍骨組織結合是口腔種植成功的關鍵。目前，臨床上多采用形態(tài)規(guī)則的錐形或柱狀種植體，這些種植體與拔牙窩外形不吻合，初期穩(wěn)定性較差。3D打印個性化鈦種植體為仿牙根形態(tài)設計，可更好模擬自然牙的傳力特性和牙根的應力分布特性，提高了骨與種植體的結合率［1］。電子束熔融 （electron beam melting，EBM） 是一種3D打印技術，采用電子束作為能量源，是使材料完全熔化后再冷卻凝固成型的三維實體制造方法。EBM后期無需熱處理，工藝流程簡化，可精準控制材料的孔隙結構，多孔部分和致密實體部分可一次成型，具有良好的結構連續(xù)性［2］。

鈦種植體表面致密的氧化鈦層具有生物惰性，無促進成骨能力。鈦種植體在模擬體液或者機體內幾乎不能誘導羥基磷灰石的沉積，只是與骨組織形成一般的骨整合，因此骨結合率較低［3］。鈦種植體表面進行改性等活化處理，可增強種植體與骨的結合，預防種植體周圍骨吸收［4］。近年來隨著材料學表面處理工藝的發(fā)展，應用微弧氧化表面處理成為鈦種植體表面改性研究的熱點。微弧氧化由陽性氧化技術升級而來，可將鈦合金表面改性形成微納米生物活性鈦涂層，促進成骨細胞在種植體表面黏附，增強附著力［5］。另外，微弧氧化技術操作方便、成本低，能有效調整所制備表面涂層的微觀結構和元素，提高種植體的成骨性和抗菌性［6］。本研究通過EBM技術制備個性化鈦種植體，并在其表面制備微弧氧化涂層，探討微弧氧化涂層對3D打印個性化鈦種植體骨愈合的作用，旨在為復合涂層3D打印鈦種植體的臨床應用提供依據(jù)，并為提高臨床種植成功率及使用壽命提供新思路。

1 材料與方法

1.1 3D打印個性化根形鈦種植體的設計與制作

通過CT （日本HITACHI公司） 檢查獲取實驗犬目標牙牙根原始形態(tài)數(shù)據(jù)，將DICM格式原始圖像導入Mimicis10.0 軟件中，選取雙側第四前臼齒作為目標牙，獲取目標牙圖像數(shù)據(jù)，建立三維模型并進行修整處理，將種植體設計為表面孔徑300 μm、孔隙率70%的多孔結構，通過EBM 3D打印機 （瑞典Arcam公司） 制作出與目標牙牙根形態(tài)高度吻合的個性化鈦種植體，共16個。見圖1。

圖1 個性化鈦種植體三維模型及制備完成的種植體樣本

1.2 微弧氧化涂層制備

噴砂拋光30 s （去除種植體3D打印過程中表面未完全熔融的殘留顆粒），丙酮清洗3D打印鈦種植體試樣15 min （去除表面鈦金屬粉末）。鹽酸∶硫酸∶去離子水按照2 ∶1 ∶1比例配置酸洗液，將種植體置入酸洗液酸蝕5 min，酸蝕后的種植體依次用無水乙醇、蒸餾水超聲清洗各10 min，常溫氮氣干燥。將16個3D打印個性化種植體均分為2組：微弧氧化涂層組和對照組。微弧氧化涂層組種植體置入含有乙酸鈣、磷酸二氫鈉、碳化硅納米顆粒的電解質溶液中處理10 min，進行表面微弧氧化；對照組種植體不做處理。通過掃描電鏡 （EVO10，德國ZEISS公司） 觀察種植體表面形態(tài)，使用X射線能譜儀 （XPS，美國ThermoVG公司） 檢測種植體的元素組成。

1.3 實驗動物、分組及手術方法

健康雄性成年比格犬4只，年齡12～18個月，體質量12～15 kg，沈陽康平實驗動物研究所提供。微創(chuàng)拔除4只實驗犬下頜雙側第四前臼齒，保證骨壁完整無破壞。每只實驗犬共有2個近中和2個遠中拔牙窩，共16個拔牙窩。將16個拔牙窩隨機分為2組，一組拔牙窩內植入微弧氧化涂層組鈦種植體，另一組拔牙窩植入對照組鈦種植體。手術方法：將個性化種植體冠方牙體部分截去，依據(jù)相應的方向植入拔牙窩內，輕敲擊或按壓就位，使種植體頂端與牙槽嵴頂平齊在無張力下縫合創(chuàng)口，10 d后拆除縫線。見圖2。術后抗感染治療，常規(guī)半流食飼養(yǎng)，定期觀察實驗犬生命體征及植入區(qū)組織愈合情況。所有犬的選擇、管理、手術方案以及術前準備處理工作都符合國際動物保健和使用委員會的要求。

圖2 拔除犬下頜第四前臼齒，并將種植體植入拔牙窩內

1.4 影像學觀察

術后2個月進行CT檢查，觀察種植體周圍骨吸收及骨愈合情況。

1.5 組織形態(tài)學分析

術后2個月安樂死實驗犬，在種植體外周0.5 cm處截斷獲取帶種植體的下頜骨標本，于4%多聚甲醛中固定24 h。采用梯度乙醇進行標本脫水，將脫水后的組織用環(huán)氧樹脂包埋，然后使用硬組織切片機（300-CP，德國EXAKT公司） 沿頰舌向種植體長軸切片 （厚度50 μm）。切片進行甲苯胺藍試劑染色，然后利用光學顯微鏡 （日本Olympus公司） 觀察組織形態(tài)。利用 Image-Pro Plus 6.0 軟件計算骨長入面積率和骨結合率。其中，骨長入面積率 （%） =骨與種植體接觸的實際面積/種植體能提供骨長入的總面積×100；骨結合率 （%） =骨與種植體實際接觸面的總長度/種植體能提供骨接觸面的總長度×100。

1.6 統(tǒng)計學分析

利用 SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用表示，2組比較采用t檢驗，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組掃描電鏡結果

結果顯示，微弧氧化涂層組鈦種植體表面較粗糙，形成TiO2膜層，表面有較多孔洞，多呈圓形、橢圓形分布；對照組鈦種植體表面呈現(xiàn)波浪狀多孔結構，見圖3。X射線能譜儀檢測結果顯示，微弧氧化涂層組表面除了鈦合金所含元素外，還具有Ca、P、Si、O、Na等元素；對照組表面僅含有鈦合金元素，見圖4。

圖3 2組掃描電鏡結果比較

圖4 X射線能譜元素分析結果

2.2 2組術后觀察及CT檢查結果

結果顯示，術后2個月2組犬體征良好，種植體牙齦軟組織創(chuàng)口愈合良好，周圍牙齦未見紅腫，未見種植體脫落現(xiàn)象。2組種植體周圍均無低密度影像，未見骨吸收，骨愈合良好，未見骨折、骨裂。見圖5。

圖5 術后2個月2組種植體CT影像

2.3 2組組織形態(tài)學結果

術后2個月制取硬組織切片并利用光學顯微鏡觀察，鏡下種植體顯示為黑色，骨組織顯示為藍色。結果顯示，鏡下見骨結合界面清晰，2組種植體周圍均有不同程度骨結合，表面均有不同程度新生骨長入。微弧氧化涂層組種植體表面被較多新生骨包繞，結合緊密，且結合面積較廣泛；種植體外層孔隙內可見有新生骨組織充填，且與周圍孔壁緊密結合。對照組種植體表面新生骨附著較少，部分新生骨組織呈游離狀態(tài)；新生骨與種植體之間可見空泡區(qū)域，骨結合面積較小且結合不緊密。見圖6。

圖6 2組組織形態(tài)學比較

微弧氧化涂層組與對照組骨長入面積率分別為34.9%±2.4%、24.6%±3.6%，骨結合率分別為40.8%±3.4%、29.6%±3.6%，微弧氧化涂層組骨長入面積率、骨結合率均顯著高于對照組 （均P< 0.05）。

3 討論

種植義齒修復已在臨床牙列缺損治療中廣泛應用。與傳統(tǒng)的早期種植和延期種植相比，即刻種植具有縮短手術時間、減少治療周期、降低治療成本等優(yōu)點。臨床上即刻種植更多應用于前牙的種植修復。已有研究［7］顯示磨牙區(qū)即刻種植骨結合良好。但在即刻種植時，現(xiàn)有螺紋狀和柱狀結構的單牙根式種植體與天然牙牙根形狀不同，與拔牙后的牙槽窩形狀不一致，種植體與骨組織間常存在間隙，既影響種植體初期穩(wěn)定性，又影響種植體和骨組織間的骨性愈合，進而影響種植手術的成功率［8］。本實驗中個性化鈦種植體為仿天然牙根形態(tài)設計，可以與其牙槽窩形態(tài)匹配，植入時不需要制備種植窩，種植體與牙槽窩之間可以更好模擬天然牙根的應力分布特性。傳統(tǒng)純鈦種植體由于材料彈性模量過高導致應力遮擋效應而容易造成周圍牙槽骨吸收、種植體脫落［9］。研究［10-11］表明，3D打印技術可制造表面具有多孔結構的鈦合金個性化種植體，調節(jié)孔隙率和孔徑使種植體具有與骨組織相匹配的彈性模量，適宜的彈性模量可有效減小鈦的應力屏障作用，多孔結構也可使個性化鈦種植體與牙槽骨之間結合面積增大，增強種植體初期穩(wěn)定性。本實驗個性化鈦種植體表面多孔結構的孔徑為300 μm，孔隙率為70%，形成具有凹面和孔隙的類骨小梁結構，有利于骨細胞生長，促進骨結合，其中表層的多孔結構能夠避免應力集中造成的牙槽骨壁吸收，同時牙根內部的實心結構也可以保證種植體的強度。本實驗中多孔結構厚度略薄，未來可增加多孔層厚度，更有利于骨組織長入。目前，制作個性化根形鈦合金種植體多選用選擇性金屬熔融 （selective laser melting，SLM） 和 EBM 技術［12］。與以激光為能源的SLM技術比較，EBM技術制備的樣本是在真空環(huán)境下完成，因而避免了樣本制作過程中受到污染；且EBM技術以電子束作為熱源，能量利用率較SLM高，加工速度快［13］。

本實驗在含有Ca、P和Si等元素的電解質中通過微弧氧化技術在種植體表面制備多孔TiO2涂層。有研究［14］顯示多孔TiO2涂層具有較高的表面能和較大的表面粗糙度，能更好促進成骨細胞黏附和擴散。本研究結果顯示，術后2個月微弧氧化涂層組種植體表面骨結合比對照組更加廣泛、緊密，空泡區(qū)域較少，接觸成骨更明顯；微弧氧化涂層組骨長入面積率及骨結合率均高于對照組 （均P< 0.05），說明微弧氧化TiO2涂層能明顯促進骨愈合，具有良好的骨誘導能力，使骨組織快速沉積到種植體表面，從而促進骨質礦化和改建，與以往研究［14-15］結果一致。

綜上所述，EBM 3D 打印技術可制作出與目標牙形態(tài)完全一致的鈦種植體，微弧氧化涂層可促進3D 打印個性化鈦種植體骨愈合。微弧氧化涂層個性化鈦種植體可作為一種性能優(yōu)良的種植體在口腔種植修復中應用。本研究樣本量較小，微弧氧化涂層促進3D 打印個性化鈦種植體骨愈合的具體機制尚未明確，今后需進一步論證。