HIF-1a/PDK1 通路活化促進(jìn)化療后殘存乳腺癌組織癌干細(xì)胞生成*

朱芳，王佑權(quán)，徐喆，王先明，屈洪波

518000 廣東 深圳，深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院 健康管理科（朱芳），甲乳外科（王佑權(quán)）；518000 廣東 深圳，深圳大學(xué)附屬華南醫(yī)院 甲乳外科（徐喆、王先明、屈洪波）

隨著新輔助治療在乳腺癌患者中的廣泛應(yīng)用，大部分乳腺癌患者經(jīng)過(guò)新輔助化療及靶向治療后能夠獲得病理完全緩解（pathologic complete response，PCR），其預(yù)后也明顯改善［1］。然而，臨床中仍有一部分乳腺癌在新輔助治療后未獲得緩解，殘存乳腺癌組織高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞（breast cancer stem cells，BCSCs）標(biāo)志物［2］。既往研究表明，BCSCs 具有自我更新和多向分化潛能，表現(xiàn)出放化療抵抗性，被認(rèn)為是乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源［3］。本研究組早前發(fā)現(xiàn)，低氧微環(huán)境促進(jìn)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中BCSCs 微球體富集，而下調(diào)低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor， HIF）-2a 表達(dá)顯著抑制BCSCs 微球體細(xì)胞的增殖［4］。近期研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1a 通過(guò)活化丙酮酸脫氫酶激酶同工酶 1（pyruvate dehydrogenasekinase isoenzyme1，PDK1）誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞糖代謝由線粒體氧化磷酸化向糖酵解轉(zhuǎn)變，使得腫瘤細(xì)胞獲得抗凋亡能力，并誘導(dǎo)產(chǎn)生酸性微環(huán)境促進(jìn)腫瘤侵襲及免疫逃逸［5］。基于此，本研究擬探討HIF-1a/PDK1 信號(hào)通路在化療后殘存乳腺癌組織BCSCs 微球體富集中的作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2021 年3 月至2022 年10 月于深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院接受診治40 例乳腺癌患者為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為新輔助化療前粗針穿刺乳腺癌組織組和新輔助化療后手術(shù)切除的乳腺癌組織組。所有病例經(jīng)術(shù)前粗針穿刺病檢確診為乳腺癌，并檢測(cè)雌激素、孕激素及人表皮生長(zhǎng)因子2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、Ki-67 及P53 的表達(dá)水平。患者均為女性，年齡33～67 歲。腫瘤臨床分期（cTNM）：Ⅱ期22 例，Ⅲ期18 例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24 例，不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16 例；分子分型：三陰型10 例，Luminal 型20 例，HER2 過(guò)表達(dá)型10 例。所有患者術(shù)前均接受6 個(gè)周期TAC 或TCbHP 方案新輔助化療。術(shù)后對(duì)乳腺癌原發(fā)灶及腋窩淋巴結(jié)再次評(píng)估，結(jié)果顯示獲得病理緩解為22 例，仍有殘存病灶為18 例。本研究經(jīng)龍華區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，倫理號(hào)：［2021］第（089）號(hào)。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

胎牛血清、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及DMEM/F-12 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；表皮生長(zhǎng)因子和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子購(gòu)自以色列ProSpec 公司； L-谷氨酰胺購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；兔抗人一抗HIF-1a、PDK1、乙醛脫 氫 酶1A1（acetaldehyde dehydrogenase 1A1，ALDH1A1）及β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，TRITC標(biāo)記鼠抗兔二抗、細(xì)胞裂解液、HRP 標(biāo)記鼠抗兔二抗IgG、BCA 檢測(cè)試劑盒及總蛋白提取試劑盒購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

圖2 倒置相差顯微鏡觀察BCSCs 微球體形態(tài)學(xué)（×200）Figure 2.Morphology of BCSCs Microspheres Observed by Inverted Phase Contrast Microscope （×200）

1.3 免疫組化法檢測(cè)兩組細(xì)胞HIF-1a、PDK1 及ALDH1A1 表達(dá)

收集化療前粗針穿刺乳腺癌組織和化療后殘存乳腺癌組織，采用SABC 法免疫組化染色，標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、包埋及切片。首先通過(guò)檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)，采用3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性酶，置入37℃孵箱孵育30 min，加入一抗HIF-1a、PDK1 或ALDH1A1（濃度為1∶200），4℃孵育過(guò)夜。采用PBS 沖洗3 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗（濃度為1∶500），置入37℃孵箱孵育1.5 h，采用DAB 顯色，復(fù)染、脫水及封片。倒置顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)500 個(gè)腫瘤細(xì)胞，判定標(biāo)準(zhǔn)如下：以上3 種指標(biāo)以細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)范圍在大于75%為4 分，在51%～75%之間為3 分，在26%～50%之間為2 分及1%～25%之間為1 分。細(xì)胞染色強(qiáng)度判定如下：棕黃色為3分，黃色為2分，淡黃色為1分及無(wú)色為0分。以上兩項(xiàng)相乘積的總分：強(qiáng)陽(yáng)性為10～12 分，陽(yáng)性為7～9 分，弱陽(yáng)性為4～6 分，陰性為≤3 分。

1.4 無(wú)血清懸浮培養(yǎng)獲得原代BCSCs 微球體

實(shí)驗(yàn)分組同前，用眼科剪將兩組癌組織塊剪成大小為1 mm×1 mm×1 mm 的小組織塊，采用D-Hanker溶液沖洗并經(jīng)過(guò)200 目細(xì)胞篩過(guò)濾，離心5 min 后加入紅細(xì)胞裂解液去掉紅細(xì)胞。采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基（serum free medium，SFM）調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/L，將稀釋后的細(xì)胞接種于低粘附6 孔板中，置入37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。每3 天進(jìn)行全量或半量換液1 次，每間隔10 天傳代1 次，每天在相差顯微鏡下觀察微球體形態(tài)并拍照留存。

1.5 有限稀釋法檢測(cè)微球體細(xì)胞單克隆形成能力

實(shí)驗(yàn)分組同前。采用Accutase 酶將微球體細(xì)胞消化并吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，以每孔200 μL 含有120、100、80、60、40、20、10 個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板，每一個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，每2 天添加25 μL 的SFM，置入37℃、5% CO2及飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，每天在倒置相差顯微鏡下觀察微球體形成情況，測(cè)定每個(gè)濃度梯度下未形成微球體孔并計(jì)算其所占比例。通過(guò)方差分析作擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，以每孔細(xì)胞數(shù)為自變量，以未形成微球體百分比作為應(yīng)變量來(lái)進(jìn)行直線回歸分析，則37%應(yīng)變量所對(duì)應(yīng)的自變量即為一個(gè)微球體所需要細(xì)胞數(shù)，由于1 個(gè)微球體來(lái)自1 個(gè)CSCs，故根據(jù)方程可以計(jì)算出BCSCs在腫瘤組織中的含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 Transwell 體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)微球體細(xì)胞侵襲能力

實(shí)驗(yàn)分組同前。采用RPMI-1640 稀釋基質(zhì)膠（1∶9），取100 μL 稀釋基質(zhì)膠加到24 孔板的Transwell 小室中，小室周圍加少許PBS；將24 孔板放入37℃孵育4 h。采用Accutase 酶將微球體細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，加入10%胎牛血清RPMI-1640 重懸成1×105個(gè)/mL。上室加入100 μL 細(xì)胞懸液，下室加入600 μL 含20% RPMI-1640 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱孵育48 h，去除上室培養(yǎng)液，棉簽擦去未侵襲細(xì)胞，加500 μL 含0.1%結(jié)晶紫于24 孔板中，放入小室，使膜浸入里面，37℃固定染色30 min，PBS 輕輕洗2 遍，倒置風(fēng)干，倒置顯微鏡下觀察遷移至人工基底膜下的細(xì)胞數(shù)量，并在200 倍光鏡下計(jì)數(shù)10 個(gè)視野細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.7 Western blot 檢測(cè)微球體細(xì)胞HIF-1a、PDK1及ALDH1A1 蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分組同前，將微球體細(xì)胞懸液低速離心去除上清，分別加入RIPA 裂解液及PMSF，將玻璃勻漿器插入冰中進(jìn)行勻漿30 min。用移液器將裂解液移至1.5 mL 離心管中，于4℃，12 000 r/min 離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到0.5 mL EP 管中；采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，將蛋白沸水煮5 min 進(jìn)行上樣，8%SDSPAGE 電泳，于80 V 電壓下電泳20 min 至分離膠處，再120 V 電壓下電泳約90 min。做“三明治”夾板，采用250 mA 恒流模式下轉(zhuǎn)膜1.5 h。放入20 mL封閉液中，于37℃孵箱中孵育2 h，加入一抗HIF-1a、PDK1 或ALDH1A1（濃度為1∶500），置入4℃孵箱中過(guò)夜。次日TBST 洗膜3 次，每次10 min，加人HRP 標(biāo)記二抗（1∶1 000），37℃孵箱中孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min。在ECL 試劑盒顯影拍照。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 關(guān)聯(lián)分析，P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 化療后殘存乳腺癌組織HIF-1a、PDK1 及ALDH1A1 表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示（圖1），HIF-1a、PDK1 及ALDH1A1 蛋白均表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，兩組呈現(xiàn)出不同程度的棕黃色顆粒，以上3 指標(biāo)在化療后殘存乳腺癌組織中表達(dá)率分別為36.5%、74.5%和49.5%，較化療前組（16.5%、32.5%和21.5%）明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。Pearson 關(guān)聯(lián)分析表明，HIF-1a 與ALDH1A1 表達(dá)存在顯著正相關(guān)（χ2= 30.2，P < 0.01， r = 0.7），PDK1 與ALDH1A1 表達(dá)也存在正相關(guān)（χ2= 21.4， P < 0.01， r = 0.5）。

2.2 化療后殘存乳腺癌組織中BCSCs 微球體分離及培養(yǎng)

顯微鏡下觀察BCSCs 微球體形態(tài)學(xué)（圖2）結(jié)果顯示：無(wú)血清懸浮培養(yǎng)至第5 天，六孔板中散在單個(gè)細(xì)胞逐漸減少，逐漸形成微球體且微球體直徑逐漸增大。培養(yǎng)至第10 天，可見(jiàn)類圓形成熟微球體形成，每個(gè)微球體包含數(shù)十至數(shù)百個(gè)細(xì)胞，微球體邊緣細(xì)胞折光性強(qiáng)，微球體可傳5～10 代。測(cè)量第10 天微球體參數(shù)，結(jié)果顯示化療前組微球體直徑及數(shù)量分別為（103.5±2.0）μm 和（2.0±1.0）個(gè)，化療后殘存乳腺癌組織組為（220.5±2.5）μm 和（2.0±1.0）個(gè)，比較微球體直徑，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.3 化療后殘存乳腺癌組織BCSCs 微球體細(xì)胞單克隆形成能力

顯微鏡下觀察第10 天BCSCs 微球體大小及數(shù)量，評(píng)估其單克隆形成能力（圖3）。After ch1、After ch2、After ch3 代表化療后殘存乳腺癌組織3 次實(shí)驗(yàn)，則形成1 個(gè)微球體每孔所需要細(xì)胞數(shù)為（29.5±1.1）個(gè)、（31.3±1.2）個(gè) 及（32.2±1.4）個(gè)，故BCSCs 平均所占比例為3.3%±0.2%；Before ch1、Before ch2、Before ch3 代表化療前乳腺癌組織3 次實(shí)驗(yàn)，形成1 個(gè)微球體每孔所需要細(xì)胞數(shù)為（60.3±3.2）個(gè)、（70.6±2.2）個(gè)及（80.5±2.7）個(gè)，BCSCs 平均所占比例為（1.4±0.2）%，故化療后組中BCSCs 含量是化療前組的2.5 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

圖3 微球體細(xì)胞單克隆形成能力直線回歸分析Figure 3.Linear Regression Analysis of Clone-Forming Ability of Microspheres.

2.4 化療后殘存乳腺癌組織BCSCs 微球體細(xì)胞體外侵襲能力

Transwell 體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示（圖4），來(lái)源于化療前粗針穿刺乳腺癌組織和化療后殘存乳腺癌組織培養(yǎng)的BCSCs 微球體細(xì)胞穿過(guò)人工基底膜細(xì)胞數(shù)分別為（22.0±3.0）個(gè)及（40.0±4.0）個(gè)。與化療前組相比，化療后殘存乳腺癌組織的BCSCs 微球體細(xì)胞穿膜數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.5 化療后殘存乳腺癌組織微球體細(xì)胞HIF-1a、PDK1 及ALDH1A1 蛋白表達(dá)

圖5 Western blot 檢測(cè)兩組微球體細(xì)胞HIF-1a、PDK1 及ALDH1A1 蛋白表達(dá)Figure 5.Expressions of HIF-1a， PDK1 and ALDH1A1 Proteins in BCSCs Microspheres in Two Group Detected by Western Blot

Western blot 凝膠成像條帶結(jié)果顯示（圖5），化療前粗針穿刺乳腺癌組織和化療后殘存乳腺癌組織HIF-1a 蛋白相對(duì)表達(dá)量為：0.3±0.1 和0.6±0.1；PDK1 蛋 白 相 對(duì) 表 達(dá) 量 為0.4±0.1 和0.7±0.1；ALDH1A1 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.2±0.1 和0.6±0.1。與化療前組相比，化療后殘存乳腺癌組織中HIF-1a、PDK1 及ALDH1A1 蛋白表達(dá)均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討 論

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤是由一群功能異質(zhì)性細(xì)胞組成，其中一小部分具有自我更新及多向分化潛能的“干細(xì)胞樣”腫瘤細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移根源［6-8］。本課題組前期研究證實(shí)，低氧微環(huán)境有利于BCSCs 富集，而小分子抑制劑LY294002 能夠阻斷PI3K/Akt 信號(hào)通路并導(dǎo)致低氧下BCSCs 微球體細(xì)胞增殖能力降低［9］。最近研究發(fā)現(xiàn)，低氧微環(huán)境下CSCs 主要依賴糖酵解參與腫瘤能量代謝和維持CSCs 表 型［10-13］。Kim 等［14］發(fā) 現(xiàn)ALDH 抑 制 劑DEAB 下調(diào)HIF-2a 表達(dá)能夠抑制小鼠4T1 細(xì)胞體外增殖能力和成瘤能力。基于此，本研究擬從低氧微環(huán)境角度探討化療后殘存乳腺癌組織中HIF-1a/PDK1 通路活化是否促進(jìn)BCSCs 微球體細(xì)胞的富集及相關(guān)機(jī)制。

研究表明，低氧微環(huán)境下腫瘤細(xì)胞通過(guò)HIFs 誘導(dǎo)干細(xì)胞相關(guān)基因（OCT4、SOX2、Nanog）表達(dá)，從而在維持CSCs 表型中發(fā)揮關(guān)鍵作用［15］。 Liu 等［16］發(fā)現(xiàn)，miR-526b-3p 通過(guò)靶向HIF-2a/Notch 信號(hào)通路抑制BCSCs 生成和化療耐藥性。而Lu 等［17］發(fā)現(xiàn)，HIF-1 和Nanog 通過(guò)協(xié)同轉(zhuǎn)錄機(jī)制共同介導(dǎo)BCSCs自我更新。本研究發(fā)現(xiàn)化療后殘存乳腺癌組織高表達(dá)HIF-1a、PDK1 及ALDH1A1 蛋白，且3 者之間具有顯著正相關(guān)，提示了化療后殘存乳腺癌組織通過(guò)激活HIF-1a 調(diào)控的PDK1 糖酵解途徑促進(jìn)BCSCs微球體細(xì)胞富集。類似的研究，Lu 等［18］發(fā)現(xiàn)，化療藥物促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中CSCs 富集，其機(jī)制是HIFs通過(guò)調(diào)控谷胱甘肽s -轉(zhuǎn)移酶1 表達(dá)發(fā)揮作用，而抑制該酶表達(dá)可降低卡鉑誘導(dǎo)的BCSCs 富集，延緩化療后腫瘤復(fù)發(fā)。

為驗(yàn)證化療后殘存乳腺癌組織的BCSCs 微球體細(xì)胞是否具有自我更新能力和侵襲潛能。本研究通過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)從化療后殘存乳腺癌組織中原代培養(yǎng)BCSCs 微球體，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。無(wú)血清懸浮培養(yǎng)被認(rèn)為是篩選BCSCs 的一種重要方式，本研究組已經(jīng)掌握該項(xiàng)技術(shù)［4］。體外成球?qū)嶒?yàn)提示了化療后殘存乳腺組中BCSCs 微球體直徑較化療前組明顯增加，考慮與微球體中含有更多處于分化頂層CSCs 有關(guān)。體外侵襲實(shí)驗(yàn)及有限稀釋實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，化療后殘存乳腺癌組織BCSCs 微球體細(xì)胞體外侵襲能力和自我更新能力明顯增強(qiáng)。這與Li 等［19］研究類似，其發(fā)現(xiàn)新輔助化療后殘存乳腺癌組織中微球體細(xì)胞成球率更高，富集更多ALDH1A1+/CD24-乳腺癌細(xì)胞，而應(yīng)用拉帕替尼能夠降低HER2 陽(yáng)性乳腺癌患者的BCSCs 比例。

那么，化療后殘存乳腺癌組織中BCSCs 微球體富集過(guò)程是否受到HIF-1a/PDK1 信號(hào)通路調(diào)控？本研究采用Western blot 檢測(cè)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的BCSCs 微球體細(xì)胞中HIF-1a 及下游靶蛋白PDK1，并探討其表達(dá)與BCSCs 標(biāo)志物的ALDH1A1 表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果顯示化療后殘存乳腺癌組織中BCSCs微 球 體 細(xì) 胞 高 表 達(dá)HIF-1a、PDK1 及ALDH1A1 蛋白。這與Peng 等［20］研究一致，其發(fā)現(xiàn)PDK1 在BCSCs 中高表達(dá)，下調(diào) PDK1 表達(dá)與ALDH+亞群及干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)降低有關(guān)，最終抑制干細(xì)胞微球體形成和腫瘤生長(zhǎng)。相反，高水平的 PDK1增強(qiáng)了BCSCs 特性，并與總生存率差相關(guān)。

總之，本研究分別從化療后殘存乳腺癌組織和體外培養(yǎng)BCSCs 微球體細(xì)胞兩方面探討了化療藥物通過(guò)誘導(dǎo)乳腺癌組織中HIF-1a/PDK1 信號(hào)通路活化，從而上調(diào)CSCs 相關(guān)標(biāo)志物ALDH1A1 蛋白表達(dá)，并在維持BCSCs 表型中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為針對(duì)HIF-1a/PDK 信號(hào)通路的靶向治療提供新的線索。

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