人內源性逆轉錄病毒K 及其在乳腺癌診斷、治療和預后中的研究進展*

朱玲玲，李婷媛，趙宇倩，余小平，陳汶

610500 成都，成都醫學院 公共衛生學院（朱玲玲）；610041 成都，四川省腫瘤臨床醫學研究中心，四川省腫瘤醫院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學附屬腫瘤醫院 科研處（朱玲玲、趙宇倩、陳汶），實驗研究部（李婷媛）；610106 成都，成都大學 基礎醫學院（余小平）；100021 北京，國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院 流行病學室（陳汶）

乳腺癌是全球常見的惡性腫瘤，2020 年，乳腺癌已超過肺癌成為全球癌癥發病率第一的腫瘤，新增病例達230 萬，占所有癌癥新發病例的11.7%［1］。由于乳腺癌早期癥狀和臨床表現不明顯，導致很多患者發現時疾病已處于晚期階段，死亡率較高，所以早期發現、早期治療顯得尤為重要，可以降低乳腺癌患者的死亡率和改善預后［2］。目前臨床上常用的乳腺癌篩查方法如乳房X 光攝影、磁共振成像等存在敏感度、特異度低，且價格昂貴、耗時長、輻射水平高、過度診斷等局限性［3-5］。因此，越來越多的研究關注分子生物標志物檢測的臨床作用，如癌癥風險評估、診斷、預后、治療等，并認為其可能是腫瘤早期防治的更好選擇［6-7］。傳統的生物標志物，如糖類抗原15-3（carbohydrate antigen 15-3， CA15-3）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen， CEA）、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、人表皮生長因子受體（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）等，敏感度和特異度均欠佳，且與特定腫瘤的特異相關性較低［8］。因此，探索更優的乳腺癌生物標志物具有重要意義。

人類內源性逆轉錄病毒（human endogenous retrovirus，HERV）是在數百萬年前由外源性逆轉錄病毒引起的生殖細胞感染，繼而整合進入人基因組的產物。其中HERV-K 是保留最完整、轉錄活性最高的家族，被證明與多種疾病相關，可能參與腫瘤的發生發展，是近年來研究最為廣泛的HERV 家族之一。多項研究表明，HERV-K 在乳腺癌的早期檢測、進展、預測轉移和預后中占據重要地位，同時具有成為乳腺癌免疫治療靶點的潛力［9-11］。綜上，本文將重點探討HERV-K 的生物學功能及其作為生物標志物在乳腺癌中的潛在應用，為乳腺癌早期篩查分子標志物的選擇提供新視角。

1 HERV 的結構、分類和生物學功能

HERV 約占人類基因組的8%［12］，是人類祖先的生殖細胞系感染外源性逆轉錄病毒后，整合入人類基因組，形成穩定的基因片段，并垂直遺傳給后代的產物［13］。此前一直被認為是退化的遺傳因素，直至1981 年被首次發現［14］。盡管針對HERV 的研究已有數十年，當前人類基因組中完整的HERV原病毒分類、功能仍未被全面分析。HERV 與外源性逆轉錄病毒的典型前病毒結構相似（圖1），通常由兩個長末端重復序列（long terminal repeats，LTR）和中間gag（如衣殼和核衣殼）、env（如信號肽、包膜表面）、pro（如參與病毒生命周期的蛋白酶）、pol（如逆轉錄酶和整合酶）四個開放閱讀框（open reading frame，ORF）組成［13］。HERV LTR 在人類基因組中廣泛分布且遺傳具有不穩定性，它們在人類染色體上是非隨機分布的，并與基因密度有關［15］。

圖1 HERV 的結構示意圖Figure 1.Structure of HERV

根據序列同源性［16］HERV 被分為3 大類：（1）Class Ⅰ家族，又稱類γ反轉錄病毒，包括 HERV-T、HERV-I、HERV-H、HERV-W、ERV-9 等；（2）Class Ⅱ家族，又稱類β反轉錄病毒，主要成員是HERV-K超家族，目前已知由11 個亞群（HML1-11）組成，其中，HML-2 與小鼠乳腺瘤病毒（mouse mammary tumor virus，MMTV）存在密切聯系，又名人鼠乳腺瘤類病毒［17］；（3）Class Ⅲ家族包括 HERV-L、HERV-L32、HERV-S 等。

既往研究表明，HERV 具有沉默、轉錄調控，參與人類胚胎發育等多種生物學功能。作為逆轉錄轉座子（transposable elements，TE）的一類，內源性逆轉錄病毒（endogenous retrovirus，ERV）通過復制粘貼機制被整合進入基因組，并具有沉默和轉錄調控的作用［18］。其次，HERV-K LTR 序列在不同位點之間存在差異，這種差異會導致不同細胞類型中的不同病毒表達發生變化。研究表明［19］，約1/3 的p53 蛋白結合位點在ERV 的LTR 中富集，在1 509個HERV LTR 區域中，約有31 萬個幾乎完美的p53 DNA 結合位點，ERV p53 位點可能參與p53 基因調節和轉錄。許多證據表明［20-22］，ERV 參與哺乳動物胎盤，通過整合進入哺乳動物的基因組后在生物系統中起作用，促炎細胞因子干擾素-γ（interferon gamma，IFNG）的轉錄網絡的形成可能與ERV 相關。Grow 等［23］在人類胚泡中檢測到HERV-K 病毒樣顆粒和Gag 蛋白，證明人類早期發育是在逆轉錄病毒產物存在的情況下進行的。ERVs 在人類早期發育過程中發揮抵御病毒入侵的作用，并表現出獨特且復雜的表達模式。

2 HERV-K 的可能的致癌機制

據估計［15］，每單倍體人類基因組中約含30~50個HERV-K 前病毒，總共有約1 000 個HERV-K 拷貝數。與其他HERV 家族不同的是，HERV-K 保留了更加完整的ORF，具有較多的編碼能力，是HERV中最年輕、最活躍的家族，類似于β外源性逆轉錄病毒家族轉錄活躍，參與多種腫瘤的癌變，是目前國內外研究的熱點。

2.1 染色體重排

HERV 原病毒可能造成基因不穩定，癌癥起源于癌基因的異常表達和抑癌基因的失活。5’LTR 和3’LTR 存在序列的相似性，可能發生同源重組，而HERV 等重復序列元件可能通過遠處位點之間的同源重組導致染色體重排。一項序列分析研究表明［24］，部分HERV-K 基因位點可發生大規模的染色體重排和易位，從而導致人類基因組進化過程中前病毒的缺失，影響細胞基因的活性從而促進癌癥的發生。一項關于前列腺癌的研究發現［25］，染色體重排會導致一種轉錄因子（E-twenty-six transformation-specific variant 1，ETV1）與HERV-K 22q11.23 位點的LTR 融合，導致截短的ETV1 異常過度表達，這種基因組調控元件的改變可能與前列腺癌發展機制有關。

2.2 促進細胞增殖

與HERV-K 編碼有關的衍生蛋白，如Np9、Rec、Env 有助于細胞增殖，被認為可能與癌癥相關。Chen 等［26］發現 Np9 不僅能激活細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、蛋白激酶B（protein kinase B， PKB）和跨膜受體蛋白（notch receptor 1，Notch1）信號通路，還可以上調β-連環蛋白，促進髓系和淋巴母細胞白血病細胞的生長。在乳腺癌、卵巢癌和白血?。?6］等腫瘤組織中也能檢測到Np9。Lemaitre 等［27］研究表明HERV-K Env 本身也具有致癌特性，其在非絨毛形成性人乳腺上皮細胞系中的表達誘導上皮至間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），這通常與腫瘤侵襲性和轉移有關。

2.3 參與免疫調節

在癌癥發展過程中，HERV 家族對機體免疫系統的調節可能發揮雙重作用：致癌和抗癌［28］。一方面，HERV 的免疫抑制功能可以降低腫瘤細胞的免疫識別，從而促進癌癥的發生。研究表明［29］，從人畸胎瘤細胞系釋放的HERV-K 顆粒、重組Env 跨膜蛋白（transmembrane protein，TM）和其TM 蛋白對應結構域的合成肽能夠抑制人類免疫細胞增殖，誘導調節多種細胞因子的表達。HERV-K Env 蛋白可以通過激活ERK1/2 通路和誘導遷移，促進EMT，從而在腫瘤的發生中發揮作用［29］。

另一方面，HERV 通過免疫激活可以抑制癌癥的發展，先天免疫受體對病毒侵入的感知能促進促炎因子的產生，迅速建立抗病毒狀態。這種免疫激活過程有助于控制感染，為由T 淋巴細胞和B 淋巴細胞介導的適應性免疫反應做準備，從而引發特定的細胞和體液免疫。HERV 的免疫原性與其在癌癥組織中表達的顯著上調相結合，可能是未來腫瘤治療的創新靶點［30］。DNA 甲基轉移酶抑制劑（DNA methyltransferase inhibitors，DNMTIs）可 以 降低DNA 甲基化水平，從而激活在腫瘤中沉默的基因，DNMTIs 對基因組去甲基化也可能導致ERV 的上調和雙鏈RNA 的產生，而逆轉錄病毒RNA 與抗病毒應答基因的激活有關。Wolff 等［31］提出，去甲基化藥物（hypomethylating agents，HMA）的核心機制是逆轉腫瘤細胞中的異常甲基化，重新激活CpG島（cytosine phosphoric acid guanine）啟動子，導致腫瘤基因的再表達，這個機制可以使表觀遺傳沉默的ERV 元件誘導干擾素反應來影響腫瘤免疫，表明低劑量的HMA 具有作為各種腫瘤類型的新治療方案的潛力［32-35］。因此，ERV 作為致癌的驅動因素，也可能有助于癌癥的免疫治療［36-38］。

3 HERV-K（HML-2）在乳腺癌防治中的作用

近半個世紀以來，不同乳腺癌亞型的靶向治療方法取得巨大進展，但乳腺癌的預防和早期發現仍需探索［39］。HERV-K 由11 個亞組（HML-1 到HML-11）組成，其中一些HML-2 原病毒具有人類特異性和多態性，是最活躍的逆轉錄病毒家族。因此，HML-2 被認為是研究潛在致癌活性方面最有價值的HERV-K 亞組。1986 年研究發現［17］，HERV-K 的env 基因產物在結構上與MMTV env 蛋白相似，同時提出HERV-K env 基因在人乳腺癌細胞中也有可能表達。次年，該團隊用女性類固醇激素刺激人類乳腺癌細胞系發現會導致HML-2 mRNA33 的顯著上調［40］，為后續HERV-K 在乳腺癌中的功能作用奠定了基礎。

3.1 HERV-K 作為乳腺癌的早期和預測轉移的生物標志物

HERV-K 在癌細胞中的顯著表達為乳腺癌的診斷和早期預測提供了潛在的生物標志物工具。研究顯示［10］，與健康組織相比，乳腺癌細胞系和患者組織中多個HERV 家族的mRNA 和蛋白質過表達。一項研究表明［41］，HML-2 的mRNA 和蛋白質水平在乳腺癌患者的血液中顯著上調。Wang-Johanning等［11］發現，患有原位導管癌和I 期乳腺癌的女性血清HML-2 mRNA 和HERV-K 抗體滴度顯著高于未患癌女性，其受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.89，與乳腺X 線檢查的AUC 相當，HERV-K 作為早期乳腺癌血清標志物的敏感度較高。同時，該團隊還發現患有原發性乳腺癌且3~4年內發生轉移的患者的血清HML-2 mRNA 往往高于未發生腫瘤轉移的患者。另一項觀察研究中［42］，223 例原發性乳腺癌患者中有66%可檢測到血清HERV-K，與HERV-K 陰性相比，其淋巴結轉移率更高。證明在乳腺癌早期，患者血液中的HERV-K（HML-2）抗體和mRNA 已經升高，且發生轉移的風險更高。最近的一項研究［43］綜合分析多數據集的HERV-K 前病毒表達譜，發現其在乳腺癌患者的乳腺組織中的表達均高于健康人。同時，該研究首次發現，位于腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）中的17p13.1 前病毒表達可以調節TP53 在ER +和HER2 + 乳腺癌中的表達。一項針對HERV-K 對乳腺癌的分子研究發現，用短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）env 敲低HERV-K 的表達，可以阻斷乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，減弱了乳腺癌細胞形成腫瘤的能力，并顯著減少轉移，證明了HERV-K Env 蛋白在乳腺癌的發生和轉移中起到了重要作用。

3.2 HERV-K 作為乳腺癌預后標志物

HERV-K-T47D-RT 是從經過激素治療的人乳腺癌細胞系中分離的逆轉錄酶（reverse transcriptase，RT）cDNA。Golan 等［44］為 了 評 估HERV-K-T47DRT 在人類乳腺腫瘤中的表達，對110 例乳腺癌活檢石蠟切片染色進行共聚焦分析，發現HERV-KT47D-RT 的過度表達與乳腺癌患者的不良預后及其總體生存率顯著相關。一項研究分別對美國195 例患者和中國110 例患者的石蠟包埋乳腺腫瘤組織中的env 蛋白表達進行了免疫組織化學評估［45］，在兩個人群中均觀察到HERV-K env陽性率與腫瘤大小、TNM 分期和淋巴結轉移顯著相關。對中國乳腺癌患者隨訪發現，HERV-K 血清高表達的患者總體生存率明顯降低，這與在腫瘤活檢組織中的研究結果保持一致。既往研究顯示［46］，HERV Rec 和Np9 蛋白和一些特異性抗體在腫瘤細胞中頻繁過度表達，可作為腫瘤診斷和治療的預后和治療性生物標志物。

3.3 HERV-K 與乳腺癌免疫治療

HERV-K 已被多項研究表明具有乳腺癌靶向治療的潛力。Wang-Johanning 等［42］使用抗HERV-K env 單克隆抗體靶向調控HERV-K 的表達，并通過體外乳腺癌細胞的生長、凋亡和異種移植瘤小鼠體內腫瘤生長來評估其抗腫瘤效果，可觀察到抗HERV-K 特異性單克隆抗體能抑制乳腺癌細胞的生長并誘導其凋亡。同時，與對照組治療的小鼠相比，使用6H5 單克隆抗體（6H5 monoclonal antibody，6H5mAb）治療的小鼠異種移植腫瘤的生長和重量顯著降低。另一項研究發現［47］，使用HERV-K env蛋白的特異性嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）對人正常乳腺上皮細胞（Michigan Cancer Foundation-10A，MCF-10A）無細胞毒性，但對乳腺癌細胞呈顯著的細胞毒性。此外，接受K-CAR 治療后的小鼠發現其乳腺腫瘤中的HERV-K 表達的下降與TP53 的上調、雙微體同源基因2（mouse double minute 2，MDM2）和p-ERK 的 下 調 顯 著 相 關［47］。Jin 等［48］研究顯示，HERV 衍生的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）中呈高表達，其在小鼠體內靶向該lncRNA 可以抑制TNBC 的進展并減小腫瘤大小，提示HERV LncRNA 可以作為TNBC的潛在的治療靶點。另外，Sheng 等［49］研究發現，通過基因或藥物消融組蛋白去甲基化酶（lysine-specific demethylase，LSD1），可以刺激HERV 的表達使其增強腫瘤免疫原性，而LSD1 表達與人類各種癌癥中的細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic CD8 T cells，CD8 T）浸潤呈負相關，包括HERV-K 在內的許多逆轉錄病毒都具有免疫抑制特性，研究表明，HERV-K Rec 已被證明與β-連環蛋白相互作用［50］，從而誘導對腫瘤的免疫耐受。因此HERV-K 蛋白及其轉錄本被認為可能是幾種癌癥類型治療的潛在靶點。

4 HERV-K 在不同腫瘤中的作用

目前的研究表明，HERV-K 可以在各種組織中產生轉錄物，其過度表達可在多種類型的腫瘤中被檢測到，如黑色素瘤［32］、前列腺癌［33］、卵巢癌［34］和乳腺癌［10］等。Rezaei 等［35］研究發現，在前列腺癌患者的組織中，前列腺惡性組織中HERV-K Gag 的表達顯著高于良性組織，有85.2%的前列腺癌患者組織中的HERV-K Gag RNA 上升，他們認為HERV-K Gag RNA 和蛋白的高表達可能是前列腺癌的敏感生物標志物，為臨床診斷提供潛在用途。在胰腺癌患者中的研究發現［36］，患者血清中HERV-K 病毒RNA 水平和抗HERV-K 抗體滴度顯著高于正常人血清，靶向HERV-K env 的shRNA 可以觀察到3 種胰腺癌細胞系和小鼠體內腫瘤生長率呈顯著降低趨勢，并且治療后肺轉移比例減少。這些數據表明，HERV-K 在胰腺癌的發生和進展中也有潛在重要作用，可能是胰腺癌早期檢測、診斷和免疫治療的潛在靶點。Steiner 等［37］利用最近新開發的生物信息學工具鑒定HERV 在癌癥基因組圖譜中的差異表達，發現在前列腺癌、乳腺癌和結腸癌中均有155 種HERV 差異表達，為未來研究HERV 在癌癥中的功能作用奠定了基礎。多項研究證明HERV-K 存在多種類型的腫瘤中，參與腫瘤的發生發展，但其關聯尚未完全闡明，與腫瘤的發病機制是存在因果關系或輔助作用尚存在爭議，有待進一步研究探討［38］。

5 HERV-K 的實驗室檢測方法

人內源性逆轉錄病毒的常用檢測方法有酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）等，反映了不同水平的基因活性。

ELISA 是一種用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。ELISA 檢測血清中的自身抗體有助于早期腫瘤患者的發現進行輔助診斷、觀測預后情況等優勢，也存在所需的抗體等材料制備困難、價格昂貴等局限性［51］。有研究使用ELISA 測定抗HERV-env 蛋白的血清抗體滴度，以檢測人類血清中的抗HERV 抗體，證明HERV-K mRNA 和蛋白質（如Rec 和Np9）是早期乳腺癌的候選血清生物標記物［11］。另外，ELISA 檢測同樣可用于逆轉錄病毒的檢測和定量分析。一項針對HERV-Kp27 CA 蛋白開發的AC-ELISA 檢測方法可用于評估畸胎瘤細胞系中HERV-K（HML-2）的表達并且具有較高的敏感度、特異度［52］，為腫瘤實驗室檢測提供了新的方法和思路。

RT-PCR 是通過內參或外參法對待測樣品中的特定DNA 序列進行定量分析的方法，檢測所需時間短、在微量檢測中占據優勢，可用于腫瘤標志物及腫瘤基因檢測從而輔助腫瘤疾病的診斷，是今年來微量病毒檢測的主要手段，在研究早期階段，Ejthadi等［53］開發了一種可以在細胞系中觀察到HERV-K的新型多重RT-PCR 系統，并通過試驗表明RT-PCR與Southern 印跡雜交法相結合，可以從乳腺癌組織中檢測到HERV-K，認為這是檢測癌細胞系和組織中的HERV-K 表達水平的新方法。然而，RT-PCR對于基因檢測的高敏感性可能造成即使是輕微的DNA 污染也會導致不良結果，造成假陽性。

目前HERV-K 的臨床檢測暫無標準操作程序、國內外相關文獻較少、臨床檢測技術還非常不成熟，具有一定局限性，限制了HERV-K 與乳腺癌之間相關性的深入探索及臨床應用研究。

6 總結與展望

過去HERV 一直被認為是無用的基因序列，伴隨著生物醫學的快速發展，HERV 已被證明與多種癌癥有關。雖然HERV 與癌癥發生的直接聯系還未被證實，它們的存在仍然對腫瘤新型生物標志物的應用十分有利。尤其是HERV-K 家族被多項研究使用RT-PCR、ELISA 等方法證明其在乳腺癌的診斷、治療和預后［11，42，45］中具有應用前景，為乳腺癌的研究提供了新思路和新方法。然而，既往大多數研究是在細胞、動物、人體血清實驗中證明HERV-K在乳腺癌中的功能作用，HERV-K 作為乳腺癌的新型標志物還處于研究階段，尚缺乏開發快速、高效和標準化的HERV-K 的臨床檢測方法及前瞻性的人群研究證明其臨床應用中的可行性，未來需開展大規模多中心的前瞻性研究加以證實。

作者聲明：本文全部作者對于研究和撰寫的論文出現的不端行為承擔相應責任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數據資料等已按照有關規定保存，可接受核查。

學術不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網（CNKI）科技期刊學術不端文獻檢測系統的學術不端檢測。

同行評議：經同行專家雙盲外審，達到刊發要求。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

文章版權：本文出版前已與全體作者簽署了論文授權書等協議。