可注射型富血小板纖維蛋白促進人臍靜脈內皮細胞成血管能力的體外實驗研究

羅琳涓, 潘 菁, 厲超元, 蔣備戰

(1. 同濟大學口腔醫學院·同濟大學附屬口腔醫院兒童口腔科,上海牙組織修復與再生工程技術研究中心,上海 200072; 2. 同濟大學口腔醫學院·同濟大學附屬口腔醫院種植科,上海牙組織修復與再生工程技術研究中心,上海 200072)

牙髓再生是治療牙髓感染或牙髓壞死的一種新方法,其中血管再生可以恢復牙齒的營養供應,被認為是功能性牙髓再生的關鍵[1]。可注射型富血小板纖維蛋白(injectable platelet-rich fibrin, iPRF)是第二代血小板濃縮制品富血小板纖維蛋白的新型衍生物,其三維纖維蛋白支架結構中富含Ⅰ型膠原,一定程度上模擬了細胞外基質的成分和結構,同時含有可以調節細胞增殖、遷移和分化行為的各種生長因子[2-3]。此外,iPRF還在調節炎癥反應、抗菌和促進成骨發生方面發揮作用[2,4-5],其液體形態便于臨床操作,可能是用于誘導牙髓再生的一種理想的支架材料。

但是目前iPRF成血管作用的相關研究較少,因此本研究利用人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)探究iPRF促進血管生成的能力,為使用iPRF進行再生性牙髓治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

高糖DMEM不完全培養基、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶、PBS緩沖液、CCK-8試劑盒(凱基,中國);胎牛血清(Gibco,美國);鈣黃綠素(Sigma,美國);Matrigel基質膠、細胞培養皿、離心管、細胞培養板(Coring,美國);濾器(Millipore,日本);血管生成載玻片(ibidi,意大利);TRIzol細胞裂解液、RNA逆轉錄試劑盒(TaKaRa,日本);低溫離心機(Thermo,美國);倒置顯微鏡(Nikon,日本)。

1.2 可注射型富血小板纖維蛋白提取液(injectable platelet-rich fibrin extract, iPRFe)的制備

本實驗經過同濟大學倫理委員會批準(倫理審查編號: [2021]-DW-70),所有志愿者知情同意。根據已經報道的實驗方案[6],抽取5名健康男性志愿者(年齡18-35歲,不吸煙,不喝酒,無血液系統疾病,近期沒有服用影響血液系統的藥物)10 mL靜脈血,在4 ℃條件下離心(離心半徑10 cm,700 r/min,3 min),吸取上層黃色液態物質即為iPRF。參考課題組前期研究方案并進行改良[7],將iPRF凍干并研磨成粉,每80 mg iPRF粉末用40 mL高糖DMEM不完全培養基浸提24 h。在細胞超凈臺中使用0.22 μm濾器過濾浸提液后得到iPRFe,保存于-20 ℃冰箱。

1.3 細胞培養

HUVECs從中國科學院細胞庫中獲得,常規培養液為添加了10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM不完全培養基,置37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養,每2 d更換1次培養液。

1.4 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力

將iPRFe用高糖DMEM不完全培養基稀釋,并添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素,使iPRFe的濃度分別為1.6 mg/mL、0.8 mg/mL、0.4 mg/mL和0.2 mg/mL。實驗分為5組,對照組為常規培養液,實驗組分別另外添加上述4種不同濃度的iPRFe,每組設置5個復孔。將HUVECs以2×103個/孔接種于96孔板,待細胞貼壁后更換為條件培養液,置細胞培養箱中培養。分別于第1、3、5 d棄去原培養液,加入含有10% CCK-8液的100 μL高糖DMEM不完全培養基避光孵育1 h,用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度值(A450)。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

實驗分為2組,對照組培養液為含有1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM不完全培養基,實驗組另外添加最佳濃度的iPRFe,兩組培養液均不含胎牛血清,每組3個復孔。將HUVECs以1×105個/mL接種于6孔板,待細胞完全融合后,用無菌槍頭在孔板底部做出劃痕標記,各組更換為無血清條件培養液,置細胞培養箱中培養。分別于0、12、24 h在顯微鏡下拍照,用Image J軟件處理圖像,比較各組劃痕愈合情況。

1.6 小管形成實驗檢測細胞成血管能力

實驗分組同1.5。血管生成載玻片每孔加入10 μL復溫可流動的Matrigel基質膠于底部,置細胞培養箱中30 min使其凝固。調整HUVECs密度為2×105個/mL,每孔加入經無血清條件培養液重懸的50 μL細胞懸液于基質膠表面,置細胞培養箱中孵育。6 h后,棄去原培養液,每孔加入50 μL濃度為6.25 μg/mL的鈣黃綠素,避光孵育30 min,PBS洗3次后熒光顯微鏡下拍照,用Image J軟件分析各組小管形成情況。

1.7 實時定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)檢測成血管相關基因的mRNA表達水平

實驗分組同1.5。將HUVECs以1×105個/mL接種于6孔板,待細胞貼壁后更換為無血清條件培養液。分別于12、24 h棄去原培養液,PBS洗3次,每孔加入1 mL TRIzol裂解細胞,根據試劑盒的說明書提取總RNA,再使用TaKaRa試劑盒逆轉錄得到cDNA,檢測血管生成素(angiogenin, ANG),C-X-C基序趨化因子受體4(C-X-C motif chemokine receptor 4, CXCR4),血小板衍生生長因子受體A(platelet-derived growth factor receptor A, PDGFRA)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA的表達水平,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內參基因。所用引物序列見表1。

表1 用于RT-qPCR的引物序列

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 iPRFe對HUVECs增殖能力的影響

用不同濃度的iPRFe處理HUVECs 12 h后發現,0.4 mg/mL濃度的iPRFe促進細胞增殖效果最佳,0.2 mg/mL濃度的iPRFe也有一定促進作用(圖1A,P<0.05)。24 h后,所有濃度的iPRFe對HUVECs增殖能力均有促進作用,其中0.4 mg/mL iPRFe組細胞增殖率高于1.6 mg/mL iPRFe組和0.2 mg/mL iPRFe組,差異具有統計學意義(圖1B,P<0.05)。因此,0.4 mg/mL濃度的iPRFe被認為是促進HUVECs增殖的最佳濃度,并被選擇用于后續實驗。

圖1 不同濃度iPRFe處理12 h(A)和24 h(B)后對HUVECs增殖能力的影響

2.2 iPRFe對HUVECs遷移能力的影響

用最佳濃度的iPRFe處理HUVECs,觀察細胞遷移情況。如圖2所示,培養12 h時,iPRFe組的細胞遷移率均大于對照組,24 h時差異更為顯著,差異具有統計學意義(圖2,P<0.05)。

圖2 iPRFe對HUVECs遷移能力的影響

2.3 iPRFe對HUVECs成血管能力的影響

小管形成實驗的結果顯示,HUVECs經iPRFe處理6 h后形成小管結構的連接點數、分支數、總長度和相對面積均大于對照組,差異具有統計學意義(圖3,P<0.05)。同時,iPRFe處理12 h和24 h也明顯提高了HUVECs中成血管相關基因ANG、CXCR4、PDGFRA和VEGF的表達水平(圖4,P<0.05)。

圖3 iPRFe對HUVECs成血管能力的影響

圖4 iPRFe處理12 h(A)和24 h(B)后對HUVECs成血管相關基因表達的影響

3 討 論

牙髓再生包括干細胞移植策略和細胞歸巢策略,相較于前者,細胞歸巢策略不需要在體外培養干細胞,也避免了可能的免疫排斥反應,因此在臨床應用上更具優勢,但尋找合適的支架材料和生長因子提高牙髓再生的成功率是需要解決的問題[8-9]。血小板濃縮制品是一類天然生物支架材料,其交聯纖維蛋白網中含有促進干細胞增殖、遷移和分化的生長因子,高濃度的血小板也在傷口愈合過程中充當關鍵調節劑,已經被用于促進口腔軟、硬組織再生[10]。其中iPRF是靜脈血經低速、低溫離心后得到的新型血小板濃縮制品,其液體形態的優勢便于被注射入復雜細小的根管系統,并在室溫下逐漸凝固,為再生醫學提供了一種實用形式[11]。

血管生成是胚胎發育、損傷修復和組織再生等生理、病理過程中的重要事件[12]。牙髓是高度血管化的組織,因此血管再生是恢復牙齒活力,維持牙齒正常發育、免疫防御和自我修復功能的基礎[1]。體內牙髓再生過程中血管化的發生可以由具有成血管潛能的牙源性干細胞直接實現,也可以是牙源性干細胞在生長因子的誘導下分化為血管內皮細胞,再發生增殖、遷移和成血管等一系列程序性事件[13-14]。本實驗選用的HUVECs源自人臍靜脈內皮,可以較好模擬生理狀態下內皮細胞的特性,常被用于構建體外成血管模型[12]。因此,本研究擬通過細胞增殖、遷移和成血管分化實驗分析iPRF對體外培養的HUVECs生物學行為的影響,初步評估iPRF在再生性牙髓治療中的應用前景。

以往的研究提出,血小板濃縮制品對細胞生物學行為的影響并不完全表現為濃度依賴性[15]。同時,課題組前期在研究iPRF對人根尖牙乳頭干細胞(human stem cells from apical papilla, hSCAPs)生物學行為的影響時也發現0.4 mg/mL的iPRFe促進hSCAPs增殖效果最佳,0.4 mg/mL的iPRFe還能明顯提高hSCAPs的遷移和礦化能力[7]。因此,本研究參考前期研究方案并進行改良,設置了1.6 mg/mL、0.8 mg/mL、0.4 mg/mL和0.2 mg/mL共4個濃度梯度用于篩選促進HUVECs增殖的最佳濃度。綜合分析12 h和24 h之后各組細胞的增殖情況后,0.4 mg/mL濃度的iPRFe被認為是促進HUVECs增殖的最佳濃度。iPRFe中被檢測到許多與細胞增殖、遷移和分化有關的生長因子[6,16],本實驗結果提示適宜濃度的生長因子對細胞增殖的促進效果最佳,過高的濃度反而達不到最好的效果。內皮細胞發生遷移是血管生成的標志行為之一,參與血管生成的早期過程[12]。劃痕實驗常用于量度細胞橫向2D遷移的能力,體外培養的細胞完全融合后,在無血清的條件下人為制造的劃痕愈合情況可以反映細胞的遷移活性。在本研究中,劃痕制造12 h后iPRFe組細胞遷移率明顯大于對照組,24 h后兩組差異更為明顯,證明iPRFe可以有效促進HUVECs的遷移能力。然而,既定的細胞行為可能是多種細胞因子和信號通路相互作用的結果,其作用機制有待進一步研究。

本研究通過小管形成實驗和成血管相關基因的檢測來探究iPRFe對HUVECs成血管的作用。本實驗使用的Matrigel基質膠是最簡單常用的體外血管生成模型,可以評估細胞在無血清條件下與基質膠中的生長因子和細胞外基質成分相互作用而形成小管樣結構的能力[17]。熒光圖片清晰展示了iPRFe組形成的小管樣結構明顯多于對照組,與軟件定量分析結果一致。同時,iPRFe也顯著提高HUVECs中成血管相關基因ANG、CXCR4、PDGFRA和VEGF的mRNA表達水平。CXCR4參與細胞內穩態,在血管生成早期招募細胞有助于血管再生[18];ANG、PDGFRA和VEGF通過激活血管內皮細胞的系列反應刺激血管生成[19-21]。這些血管生成標志物在iPRFe組的高表達也證明了iPRF的促血管生成能力。據報道,iPRF內含有可以調節血管生成的多種生長因子,包括高濃度的血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)、轉化生長因子(transforming growth factor, TGF)和VEGF等,可以緩慢釋放長達10 d以上[6,16]。以往的一項體外共培養模型也發現,iPRF可以上調促血管生成因子VEGF的表達[22]。iPRF聯合明膠納米顆粒也被報道可以促進血管生成和成骨,有利于拔牙后的牙槽嵴保存[23]。總的來說,iPRF在促進血管生成的多個事件中都發揮了促進作用,其促血管生成和組織再生的能力得到初步驗證。然而,本研究還有很大的局限性,因為HUVECs不存在于生理狀態下的牙髓組織中,不能完全代表牙髓再生過程中干細胞的生物學行為。因此,基于本研究的結論,本課題組計劃進一步探究iPRF對牙髓內固有細胞成血管分化能力的影響,更好地闡明iPRF用于臨床牙髓再生的可行性。

綜上所述,本研究結果表明iPRF對體外培養的HUVECs增殖、遷移和成血管分化能力具有促進作用,為可注射型富血小板纖維蛋白應用于再生性牙髓治療提供了一定理論基礎,但其分子機制及臨床轉化的效果有待進一步探究。