產黑普氏菌刺激原代人口腔角質細胞的時間序列基因表達譜研究

邵如如, 鄭章龍, 徐 盼, 郭藝婷, 何 園

(同濟大學口腔醫學院·同濟大學附屬口腔醫院口腔黏膜病教研室,上海牙組織修復與再生工程技術研究中心,上海 200072)

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)是一種常見的口腔黏膜慢性炎癥性疾病。據估計,該疾病影響了大約1%的普通人群,平均發病年齡約為60歲,女性較為多見。該疾病被WHO歸類于口腔潛在惡性疾病,惡性轉化率為0.44%-1.4%。OLP病理學表現為固有層存在具有帶狀外觀的炎性浸潤以及上皮基底細胞層液化變性,浸潤的淋巴細胞主要CD4+和CD8+T細胞,其發病機制目前尚不清楚[1]。

微生物在維持口腔健康方面起著重要的作用。特定情況下,微生物與人體之間的動態平衡被打破,導致菌群失衡,一些共生菌群轉化成致病菌,誘發多種疾病[2]。近年來,微生物感染在OLP發病機制中的作用引起人們的廣泛關注,最近多個研究證明了OLP患者的唾液和組織樣本中微生物群落多樣性和組成與健康受試者相比存在顯著差異[3-4]。本課題組前期研究發現,OLP患者頰黏膜表面微生物群落結構與健康人群相比明顯不同。進一步通過高通量測序分析發現,產黑普氏菌(Prevotellamelaninogenica,Pm)在OLP頰黏膜表面構成比顯著增加,并且Pm侵入OLP組織的上皮層和固有層[5-6],這均提示我們Pm可能在OLP的發生發展中起到重要作用。

本研究對Pm刺激原代人口腔角質形成細胞(primary human oral keratinocytes, pHOKs)的轉錄組測序數據,通過Mfuzz包進行時間序列分析,以探討相關生物學分子的動態模式以及Pm與宿主細胞相互作用的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 Pm-pHOKs細胞共培養模型及轉錄組數據的獲取

Pm-pHOKs細胞共培養模型及轉錄組數據來自課題組前期郭等人的研究[7]。

1.2 數據預處理和差異表達基因的篩選

用HTSeq分別對共培養組和對照組樣本進行reads計數。使用DESeq2進行差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)篩選,Ashr算法對logFC進行校正。取差異倍數絕對值≥1且P≤0.01的基因篩選為差異具有統計學意義的DEGs。

1.3 DEGs的聚類分析

用于軟聚類微陣列數據的Mfuzz[8]克服了傳統聚類的弱點。在這項研究中,Mfuzz用于進行DEGs的聚類分析。其中C值設為3,m值為3.71。分別在Pm處理不同時間下篩選具有一致表達趨勢的基因。根據聚類結果鑒定上調基因和下調基因,簇中上調基因表現為持續上升趨勢,下調基因表現為持續下降趨勢。

1.4 功能富集分析

利用R語言富集常用包ClusterProfiler分別對3個簇中包含的基因進行功能富集分析,包括基因本體論“生物學過程”注釋類別和重要的京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)途徑。校正后P<0.05表示DEGs的顯著富集的GO和KEGG途徑。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用網絡和模塊分析

用于檢索相互作用基因的搜索工具STRING是一種探索潛在蛋白質-蛋白質相互作用的在線工具,它由已知的和預測的PPI組成。分別提取3個簇中的DEGs,利用STRING數據庫(https:∥cn.string-db.org/)進行蛋白-蛋白互作分析。使用Cytoscape軟件(版本3.9.1)對蛋白互作結果進行可視化,進一步利用Cytohubba插件對DEGs按EPC、Degree、Closeness、MNC算法計算評分位于前10的基因,再取交集,得到樞紐基因(Hub基因)。

1.6 HaCaT細胞培養

將HaCaT細胞(中國科學院細胞庫)接種于含有10%的胎牛血清的DMEM培養基(Hyclone,美國)中,并在37 ℃,5%CO2環境下培養。培養基2-3 d更換1次。常規傳代,取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.7 細菌培養

將P.melaninogenica(ATCC?25845TM)涂布于厭氧基礎血平板,厭氧環境下培養,挑取單個菌落接種于厭氧基礎肉湯中,置于37 ℃搖床過夜培養,用新鮮肉湯將菌液稀釋至OD600為0.1,培養至對數期收集菌液,離心(離心半徑10 cm,3 000 r/min,5 min)棄上清液,PBS清洗3次后,用新鮮培養基調整OD600=1.0,用于實驗。

1.8 實時熒光定量PCR驗證Hub基因

將HaCaT細胞以2×105個/mL的細胞密度均勻種植于12孔板,24 h后去除培養基,PBS清洗3次后加入不含胎牛血清的DMEM培養基,感染組和對照組分別吸取1 μL菌液和1 μL的DMEM培養基,放置于含5%CO2的37 ℃孵箱內培養4、24 h后去除培養基,PBS清洗3次,加入TRIzol試劑,冰上孵育5 min后將RNA收集至離心管內,氯仿法提取RNA。根據反轉錄試劑盒(TaKaRa,日本)說明書將每個樣本的總RNA轉化為cDNA。根據實時熒光定量試劑盒(TaKaRa,日本)說明,確定相應的反應條件: 95 ℃ 30 s,隨后進行40個95 ℃ 5 s和60 ℃ 31 s的循環。所有樣本一式3份。GAPDH作為內部對照,所用引物信息見表1。

表1 關鍵基因的引物序列

1.9 統計學處理

目的基因相對表達量采用CT對比法確定水平(2-ΔΔCt)。采用單因素方差分析對多組數據間進行比較,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 DEGs篩選

通過分析Pm刺激pHOKs的高通量測序數據發現,在本次測序所獲取的全部基因中,相較于對照組,4 h組與24 h組分別有1 455個、1 385個基因的表達存在統計學差異,見圖1。

圖1 實驗組和對照組的基因表達

2.2 DEGs的聚類分析

通過軟Mfuzz聚類算法,將4 h和24 h組的DEGs按照其隨時間變化表達的相似性分為3個簇,分別獲得簇1(包括561個基因),簇2(包括262個基因),和簇3(包括303個基因)。簇1中的基因隨時間延長其表達呈現下降的趨勢,相反,簇2中的基因表達值呈現上升的趨勢,簇3的基因表達值在刺激前期(4 h)顯著上調,后期(24 h)顯著下調,見圖2。

圖2 3個聚類的基因表達變化

2.3 DEGs的GO功能富集分析

圖3顯示了3個簇包含的DEGs生物學過程功能富集結果。其中,橫軸代表各個簇,縱軸代表GeneOntology數據庫中對應GO的條目名稱。與簇1中的DEGs相關的生物學過程為上皮細胞分化的調控、上皮細胞向間充質細胞轉化的負調控、間充質細胞生長。簇2中的DEGs主要富集的生物學過程為細菌來源的分子的反應、對脂多糖的反應、烯烴化合物代謝過程、二萜代謝過程、視黃醇代謝過程、細胞對生物刺激的反應。簇3中的DEGs主要富集的生物學過程為對脂多糖的反應、細胞因子介導的信號通路、白細胞遷移、細胞趨化作用、對IL-1的反應。

圖3 差異表達基因GO功能富集分析結果示意圖

2.4 DEGs的信號通路分析

對3個簇中的DEGs進行了KEGG信號通路分析,如圖4所示,簇1中的基因沒有富集到相關通路,簇2中的基因主要參與金黃色葡萄球菌感染、類風濕性關節炎、TNF信號通路、IL-17信號通路、甾類激素生物合成、細胞因子與細胞因子相互作用等通路。簇3中的基因主要富集在類風濕性關節炎、TNF信號通路、IL-17信號通路、細胞因子與細胞因子相互作用、病毒蛋白與細胞因子及細胞因子受體的相互作用、癌癥中的轉錄失調、脂質和動脈粥樣硬化、Toll樣受體信號通路等通路。

圖4 差異表達基因KEGG富集分析

2.5 PPI網絡和Hub基因

通過利用STRING在線工具,構建3個簇中DEGs的PPI網絡,見圖5。

圖5 3個聚類中差異基因的PPI網絡

在PPI網絡中篩選出簇1中的2個Hub基因為VEGFA、GDNF;簇2中的8個Hub基因分別為CSF2、CCL5、CXCL1、PTGS2、ICAM1、CD86、MYD88、TNFAIP3;簇3中的8個Hub基因分別為TNF、IL-6、CXCL8、CXCL10、CCL2、IRF1、MX1、IFIT1,見圖6。

圖6 用Cytohubba插件中4種不同算法所確定的Hub基因

2.6 實時熒光定量PCR驗證結果

隨機選取3個簇中部分Hub基因進行實時熒光定量PCR檢測,結果表明,簇1中的GDNF在4 h時與對照組相比顯著下調(P<0.05),24 h時下調趨勢更為顯著(P<0.01)。而簇2中的基因PTGS2則隨著時間延長其表達量逐漸上調。簇3中的基因IRF1及IFIT1在4 h時均顯著上調(P<0.01),而24 h時與對照組相比差異無統計學意義,實時熒光定量PCR結果與轉錄組測序結果一致,見圖7。

圖7 實時熒光定量PCR驗證RNA-Seq結果

3 討 論

宿主和微生物之間的相互作用在時間和空間上是高度動態的,特別是在感染的情況下,病原體數量、微生物表型和宿主反應的性質通常會隨著時間的推移而發生巨大變化[9]。對時間序列中動態變化的基因的探究有助于更好地理解宿主與微生物相互作用的機制,為疾病預防與臨床治療提供信息。故本研究基于時間序列分析,對Pm刺激pHOKs的RNA-seq數據進行數據挖掘,根據數據的特點及需要采用Mfuzz算法將DEGs劃分為3個聚類,并對每個聚類中的基因進行GO、KEGG以及STRING網絡分析,并篩選出Hub基因,利用實時熒光定量PCR對部分基因進行驗證。

Mfuzz算法可以對來自不同時間點的DEGs進行聚類,以顯示它們的漸進式表達式動態[10]。分析微陣列數據時常用的方法是聚類技術,但通常是基于硬聚類方法,即其中一個基因(或樣本)被精確地分配到一個聚類。然而,硬聚類存在信息丟失等缺點。相比之下,軟聚類方法可以將一個基因分配到多個聚類,它克服了傳統硬聚類技術的不足,并具有進一步的優勢[11]。除了Mfuzz算法之外,還有一些類似的基于模糊聚類的算法,例如: Fuzzy C-means(FCM)算法[12]、Possibilistic C-means(PCM)算法等[13]。

上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程,已被證明為一種可逆過程[14]。當負調控上皮細胞向間充質細胞轉化過程相關基因下調時可促進EMT,上皮細胞失去細胞-細胞連接和基底-頂端極性。此前有研究報道稱EMT相關標志物claudin-1,claudin-4和E-鈣黏蛋白在OLP中的表達與對照組相比顯著降低。提示OLP的上皮層存在細胞黏附和極性失調[15]。本研究結果顯示,簇1中的基因與上皮細胞向間充質細胞轉化的負調控相關,提示EMT可能是OLP的早期病理過程,當Pm與口腔角質形成細胞相作用,可激活EMT,使上皮去極化并破壞其緊密和黏附,導致細菌進一步地侵入上皮與固有層。

此外,簇2的差異表達基因隨時間延長其表達持續上調,通過GO分析提示與視黃醇代謝過程相關。進一步分析數據發現,在Pm刺激原代人口腔角質形成細胞模型中與視黃醇代謝途徑相關的基因AKR1B10的表達顯著上調。AKR1B10是視黃酸代謝中的關鍵酶,即醛固酮還原酶家族1成員B10。目前研究表明,AKR1B10在乳腺癌[16],口腔鱗狀細胞癌[17],肺癌[18],肝癌[19],喉癌[20]等腫瘤中過表達,此外AKR1B10的上調還見于銀屑病、瘢痕疙瘩、特應性皮炎等患者的皮膚慢性炎癥中。OLP相關轉錄組數據集GSE52130[21]中,AKR1B10的表達水平較健康人群的上皮樣本高,提示該基因可能在OLP病理過程中起到重要作用。

簇3中的基因主要富集于與對脂多糖的反應、細胞因子介導的信號通路、白細胞遷移、細胞趨化作用等生物學過程相關,其表達在刺激前期上調,后期下調。有研究發現一些微生物已經進化出許多適應性機制逃避免疫監視,如牙齦卟啉單胞菌通過利用宿主自噬機制在牙齦上皮細胞中成功存活[22],此外牙齦卟啉單胞菌能夠在細胞間傳播,有學者研究發現牙齦卟啉單胞菌的細胞間易位是通過基于肌動蛋白的膜突起介導,繞過了將細菌釋放到細胞外基質中的需要,從而避開免疫系統的清除[23]。綜合上述,我們推測早期Pm黏附于上皮細胞表面,細胞分泌細胞因子、趨化因子和防御素等免疫效應物抵抗其入侵。后期Pm可能通過類似機制入侵上皮細胞,逃避免疫監視,從而導致炎癥的慢性遷延與復發。對Pm可能產生的適應性機制進行研究有助于深入理解OLP的病理過程。

本研究進一步篩選了3個簇的Hub基因,簇1中的GDNF負責編碼神經營養因子,該因子的下調與炎癥性腸病患者的屏障功能降低密切相關[24-25]。在本研究中GDNF的轉錄在Pm刺激的pHOKs中顯著下調,這表明GDNF可能在介導Pm刺激后pHOKs屏障功能障礙中發揮重要作用。簇2中PTGS2又稱為COX2,是產生疼痛介質PGE2的重要酶,PGE2的水平升高可能使周圍感覺神經敏感,導致疼痛信號更頻繁地傳遞到大腦[26]。有學者發現與OLP網狀型相比,糜爛型病變中COX-2的表達顯著增加[27]。臨床上,OLP患者通常會表現為口腔的燒灼感或疼痛癥狀,這可能與Pm刺激后pHOKs中COX-2表達升高有關。此外簇2中還包括基因GM-CSF,有文獻報道,口腔鱗狀細胞癌患者存在唾液微生物組生態失調,產黑普氏菌的豐度較高,且患者唾液中IL-8、IL-6、TNF-α、GM-CSF和IFN-γ顯著升高,表明產黑普氏菌有可能增加口腔鱗癌患者口腔唾液中GM-CSF的表達,促進鱗癌的發展[28]。提示OLP中GM-CSF的表達上調可能與產黑普氏菌的毒力相關。我們還注意到簇3的Hub基因包括IL-6,研究表明銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)分泌的胞外毒力蛋白LasB是炎癥反應的觸發因素,在PA感染急性期,LasB激發宿主產生大量促炎細胞因子,如IL-6[29]。同時LasB可降解宿主細胞表面受體及細胞因子,直接破壞宿主組織細胞和免疫防御系統。如在囊性纖維化患者中,LasB下調IL-6/STAT3通路,抑制上皮細胞修復,導致慢性炎癥的建立和維持[30]。故推測早期Pm刺激pHOKs誘導免疫反應,導致促炎因子IL-6上調,后期Pm可能產生某種毒力因子通過直接降解免疫介質IL-6或間接下調IL-6的產生來逃避免疫調節。為檢驗轉錄組數據是否準確,隨機選取4個Hub基因進行實時熒光定量PCR檢測,結果表明測定結果與轉錄組測序結果得到的差異基因表達變化趨勢一致,表明本研究中轉錄組測序得到的數據是可信的。

本研究旨在通過時間序列分析,全面了解人口腔角質形成細胞對Pm感染反應的動態變化。通過研究我們發現與視黃醇代謝相關的基因以及負調控EMT的基因在OLP中異常表達可能與Pm入侵上皮細胞有關,并且Pm入侵上皮細胞后可能通過一些適應性機制逃避免疫監視,從而導致慢性炎癥持續存在。這些發現將有助于更好地理解Pm在OLP的發生發展過程中與宿主細胞相互作用的潛在機制,同時為Pm感染所致疾病的發病機理研究提供一定的參考,為Pm感染相關疾病的預防和臨床治療提供理論基礎。但本研究仍存在一些局限性: 在本次實驗中,只選擇了3個時間點收集樣本,對于分析的結果有待進一步通過擴大不同時間點的樣本量來驗證。此外我們只分析了部分基因,還有更多生物分子信息有待深入研究。針對已挖掘的關鍵基因,后續將在實驗樣本中驗證其在Pm與細胞相互作用中發揮的功能,以期為Pm感染相關疾病的臨床治療提供理論基礎和實驗證據。