糖萼、肝素結合蛋白在膿毒癥凝血病中的研究進展

張少康, 劉 楊

(1. 同濟大學附屬東方醫院重癥醫學科,上海 200120; 2. 大連醫科大學研究生院,大連 116044)

膿毒癥患者死亡率高,一直是醫療界關注和研究的熱點。膿毒癥患者中大約50%-70%合并凝血功能障礙,其中35%的患者會進展至播散性血管內凝血,發生膿毒癥凝血病(sepsis-induced coagulopathy, SIC)的患者其病死率增加28%-43%。根據研究,膿毒癥凝血病發病機制一方面包括促凝物質上調,例如組織因子釋放增加。另一方面包括抗凝物質的下調,例如抗凝血酶血栓調節蛋白、組織因子途徑抑制物的減少。同時還包括纖維蛋白溶解機制受損等。其中以促凝物質上調導致高凝狀態最為重要。除此之外,糖萼破壞引起的內皮環境紊亂。肝素結合蛋白通過結合糖萼對內皮的影響。也可能是SIC發生發展的重要生理機制。本文的目的在于通過近年研究,通過介紹糖萼、肝素結合蛋白的結構、來源以及肝素對二者的影響來進行綜述。

1 糖 萼

1.1 糖萼的結構

血管內皮糖萼是血管內皮腔側表明覆蓋著的一層多糖蛋白質復合物。目前,總結過去數十年的研究,Dull等[1]認為血管內皮糖萼主要包括蛋白聚糖及其糖胺聚糖鏈等。其中糖胺聚糖為糖萼中含量最多的成分,由硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、硫酸角質素和透明質酸、多配體蛋白聚糖-1等多種成分組成。而硫酸乙酰肝素是糖胺聚糖的主要成分,占比約50%-90%。

1.2 糖萼的功能

血管內皮糖萼的主要生理功能之一在于調節血管壁的選擇通透性。負電性的血管內皮糖萼與吸附的血漿成分帶陽離子成分如Na+、左旋精氨酸、陽離子多肽、白蛋白等,共同隔絕血液與內皮細胞直接接觸[2],通過選擇性限制液體和血漿大分子向內皮細胞膜的轉運,維持體液平衡和內皮細胞穩態。關于毛細血管通透性的研究發現,倉鼠的微血管經透明質酸酶處理后,大分子物質又更易穿越血管內皮,證明透明質酸在糖萼選擇性通透屏障功能中起到重要作用[3]。

血管內皮糖萼的另一生理功能是調控白細胞與內皮細胞間的相互作用。血管內皮糖萼在空間上限制了血細胞與內皮細胞的接觸[4],糖萼破壞以后,白細胞與內皮細胞間的相互作用模式發生變化,進而影響白細胞的激活、黏附與內皮的破壞。另外,血管內皮糖萼在內皮細胞力學信號轉導中亦起著重要作用[5]。用酶選擇性去除糖萼的特定糖胺聚糖[5],可抑制剪切力誘導的牛主動脈內皮細胞的一氧化氮生成,表明血管內皮糖萼對擴血管物質的釋放有促進作用。所以,糖萼有維持血管系統穩態的功能,包括控制血管通透性和微血管張力,防止微血管血栓形成,調節白細胞黏附[6]。

1.3 膿毒癥相關炎癥介質促進血管內皮糖萼脫落

血管內皮糖萼的完整性在維持血管內皮的功能中有著不可或缺的作用。Lipowsky等[7]在構建的小鼠炎癥模型中觀察到血管內皮糖萼在小鼠炎癥發生發展過程中出現快速脫落,這可能是因為炎癥發展中炎癥介質如活性氧、活性氮、中性粒細胞彈性蛋白酶、腫瘤壞死因子等的釋放使糖萼結構的完整性受損,進而影響其功能。當血管內皮糖萼的結構被破壞以后,其掩蓋的血管內皮細胞胞間黏附分子和血管細胞黏附分子暴露,使得血液循環中的白細胞更易與血管內皮細胞發生黏附,進而引起后續一系列的生理變化[8]。因此,炎癥反應時糖萼脫落可以被認為是血管內皮細胞對炎癥介質的應激反應[9]。

膿毒癥時炎癥反應中血管內皮糖萼的結構被破壞之后,其功能發生了下列變化: 首先,血管內皮糖萼的屏障功能削弱或喪失,藏匿于其中的多種信號分子和酶亦同時喪失,糖萼對血管內皮細胞的保護作用減弱。其次,糖萼的機械應力轉導功能削弱或喪失,產生一系列病理改變,包括血管通透性增加,水腫產生,內皮細胞與白細胞的相互作用模式發生變化,凝血系統和抗氧化系統的失衡以及血管緊張度降低等[10]。以上均表明糖萼的破壞參與了膿毒癥的病理變化。

1.4 血管內皮糖萼在膿毒癥炎癥、凝血功能紊亂中的作用

血管內皮糖萼的脫落物在膿毒癥患者的炎癥發生發展中發揮著促進作用。硫酸乙酰肝素是血管內皮糖萼糖胺聚糖的主要成分,廣泛存在于血管細胞表面和基質中[11]。一系列的體外細胞實驗證實,硫酸乙酰肝素是P-和L-選擇素的潛在配體[12],可結合促炎趨化因子[13],促進趨化因子跨膜轉運。血管內皮硫酸乙酰肝素還參與調控炎癥反應的多個階段[14]。因此,糖萼破壞后的產物可參與到炎癥發生發展的細胞分子機制中。

健康的血管內皮被糖萼覆蓋,而膿毒癥凝血功能障礙主要是由于內皮進行性的破壞和損傷,因此,在膿毒癥中糖萼的破壞增加了血栓形成幾率。一方面,糖萼的脫落增加了受損內皮的毛細血管通透性和細胞黏附[15]。這使得內皮細胞抗凝、抗栓的作用降低[6]。目前已有研究證實,糖萼中完整的硫酸肝素鏈作為抗凝血酶Ⅲ的結合位點[16],這是抑制凝血因子的主要抗凝血分子。同樣,組織因子途徑抑制劑(tissue factor pathway inhibijtor, TFPI)也可以與硫酸肝素結合[17],抑制促凝過程的早期階段。另一方面,糖萼還具有血管內穩態所必需的額外功能。糖萼的黏性、彈性、凝膠狀的一致性使它可以作為一個機械傳感器,在調節血管張力時起到重要作用[18]。在血管流動存在的情況下,完整的糖萼可以將流體剪切力轉導到內皮細胞,促使內皮型一氧化氮合酶的誘導和一氧化氮的產生,這可以使得血管保持舒張狀態。這種剪切力的機械轉導,使血管有良好的自動調節能力,從而保持合適的血流速率[5]。研究發現,如果內皮細胞糖萼大量破壞丟失,從而暴露內皮細胞表面細胞間黏附分子1和血管細胞黏附分子1,將促進白細胞的黏附[19]。而且糖萼的黏性結構在防止血小板異常的血管黏附中也起到重要作用[8]。所以在膿毒癥凝血紊亂過程中,糖萼具有抗凝抗栓、防止血細胞聚集和抗黏附作用。

2 肝素結合蛋白

2.1 肝素結合蛋白的來源及相關生理機制

肝素結合蛋白(heparin-binding protein, HBP)是一種來源于中性粒細胞(polymorphonuclear, PMN)的多功能顆粒蛋白[20],也稱為天青霉素或CAP37,主要存在于PMN的分泌囊泡和嗜藍顆粒中。PMN在與內皮細胞表面的細胞黏附分子接觸后被激活[21],隨后HBP釋放導致細胞內皮通透性增加,并進一步導致PMN向感染部位的擴散[22]。有研究發現,HBP也存儲在嗜酸性顆粒中,但此種細胞胞吞胞吐傾向較低,僅在PMN滲入組織后才釋放[23]。因此,HBP主要來源于PMN,并激活單核細胞和巨噬細胞,誘導血管滲漏和水腫的形成。

2.2 肝素結合蛋白在膿毒癥中的預測作用

HBP已廣泛應用于重癥監護室中感染患者的監測。一系列的研究證實膿毒癥伴器官衰竭患者血漿HBP水平顯著升高,并與其短期內死亡率明顯相關,血漿HBP高于正常值上限患者的28 d死亡率是血漿HBP位于正常值范圍內患者的4倍[24]。有學者評價HBP與傳統生物標志物對照作為膿毒癥標志物的價值,發現嚴重膿毒癥患者在發生休克前期血漿中HBP水平已經升高[25],其時間窗明顯早于C反應性蛋白、IL-6、降鈣素原及乳酸等現有常規感染性生物標志物[26]。同時,血漿HBP在15 ng/mL時相比于其他感染性指標能更好地預測膿毒癥的發生,其靈敏度為87.1%,特異度為95.1%[27]。因此在膿毒癥休克患者中,HBP是預測膿毒癥發生與患者不良預后的重要標志物。

2.3 肝素結合蛋白與凝血

肝素結合蛋白在膿毒癥凝血病中的研究較少。但研究已證實,激活的PMN釋放HBP會引發血管內皮細胞損傷,導致血管滲漏。此過程將提高局部凝血因子水平,也增加暴露內皮下外源性凝血因子的機會,可能參與了局部凝血紊亂。在一項胸心外科圍手術期HBP水平的研究發現[28],HBP可與血管內皮上的糖蛋白相結合,從而引起內皮功能紊亂,進而促進SIC的發生發展。同時,Aquino-Domínguez等[29]發現血小板含有、分泌和轉譯HBP的能力,且低濃度的HBP可以防止血小板聚集和激活,表明肝素結合蛋白可能對凝血過程有重要意義,與SIC的生理機制存在某些關系,但仍需進一步發現。

3 糖萼、HBP在膿毒癥相關性凝血病中的相互作用關系

3.1 糖萼是循環中HBP的主要結合點

膿毒癥時激活的中性粒細胞釋放HBP入血后,HBP如何與內皮細胞發生作用仍待明確,但已有研究證實糖萼是HBP的主要結合部位。在對肝素結合蛋白與內皮細胞研究中,刺激中性粒細胞釋放HBP后與人臍靜脈內皮細胞共同培養。用硫酸軟骨素酶處理內皮細胞糖萼的糖胺聚糖側鏈,脫落糖萼所得到上清液經凝膠電泳分離,可同時發現脫落的HBP存在。進一步使用硫酸肝素型蛋白聚糖單抗3G10標記,證實了糖萼的硫酸肝素蛋白聚糖是血管內皮表面HBP的主要結合點[30]。這些發現提示中性粒細胞釋放的HBP首先與血管內皮表面的糖萼結合,而不是與內皮細胞直接結合。

3.2 肝素對糖萼的保護作用間接起到內皮保護作用

完整的內皮具有多種抗凝血特性,這點在膿毒癥患者中尤為重要,當內皮糖萼破壞增加時,一氧化氮、前列環素和組織因子途徑抑制劑的產生和釋放[31]會受到相應的影響,同時也會導致硫酸肝素的降解,硫酸肝素是血漿中循環抗凝血酶在內皮[32]腔表面和基底膜的結合點,當內皮糖萼被破壞后,可導致循環抗凝血酶的缺乏,此外,血管內皮表面失去糖萼形成的保護作用層,將導致白細胞和血小板在血管內皮的黏附和微血栓的形成[33],這一系列的改變加重了膿毒癥患者體內的凝血功能紊亂。

肝素是一種具有抗凝血劑和抗炎特性的糖胺聚糖,廣泛用于臨床預防靜脈血栓栓塞,也在膿毒癥凝血病時抑制異常凝血過程,其機制仍待明確。目前已知肝素與糖萼中的糖胺聚糖具有類似的結構,所不同的是糖基和硫基的位置和數量不同,所以本身肝素具有作為外源性糖胺聚糖的可能,參加修復或保護糖萼[34]。例如Yini等[35]在試驗中發現,肝素的使用減少了糖萼的脫落。同時研究發現肝素可抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的降解。從而調節血管通透性、微循環張力、白細胞和血小板黏附、止血等作用[36]。而在膿毒癥中,肝素通過抑制HPSE和隨后的硫酸肝素分解來保護糖萼不受降解。一項研究報道,肺微血管中糖萼變薄是由TNF-α依賴性肝素酶激活后硫酸肝素降解引起的,而肝素治療可削弱這種降解[8]。通過這些研究發現,肝素在多方面對糖萼具有保護作用,并通過該方式起到對內皮的保護作用。

3.3 肝素通過競爭性結合HBP保護糖萼和內皮細胞

在肝素結合蛋白早期的研究就發現其具有與肝素相結合的能力,這也是其命名的來源,但對肝素結合蛋白與肝素其在體內的研究不多。一項關于HBP在心胸外科手術中的動力學表現的研究發現,圍手術期患者靜脈使用大劑量肝素可顯著提高患者血漿HBP水平。與感染相關的HBP升高不同,這些患者血清HBP的升高并不是中性粒細胞激活所導致,而是肝素促進吸附在內皮或者其他細胞表面上的HBP釋放引起。進一步研究明確其機制為大劑量帶負電荷的肝素與原本結合在內皮細胞糖萼中帶負電荷的蛋白聚糖的HBP結合,從而使得HBP脫離糖萼進入血液,成為可探測到的游離或與肝素形成復合體的形式,表現出HBP的顯著升高[28]。

肝素與HBP存在一定競爭關系。HBP釋放后可從循環中迅速消失,主要分布到肝細胞,并有部分由脾臟的單核/巨噬細胞攝取。而一部分HBP通過受體介導進入內皮細胞,該過程稱之為內化。有國外學者為了更詳細地研究HBP的內化過程,將人臍靜脈內皮細胞與50 μg/mL的HBP預孵育,觀察HBP被轉移進入內皮細胞的量。發現如果加入100 μg/mL的肝素,與50 μg/mL HBP和內皮細胞共同孵育,83%±8%的內皮細胞HBP內化被阻止。由此可推斷肝素抑制HBP到內皮細胞的內化與肝素和糖胺聚糖競爭HBP的結合,使HBP脫離糖萼有關。此外,實驗過程中發現內皮表面的硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素等糖萼的結構物質是HBP結合的位點,其結合產物為HBP結合蛋白多糖[30]。同時也說明糖萼可作為HBP作用于內皮細胞前的一個“緩沖區域”,減少了HBP與內皮細胞直接接觸的機會。

肝素與糖萼表面的HBP競爭性結合原理可能與三者蛋白結構和電荷相關。肝素作為一種糖胺聚糖,是已知帶負電荷密度最高的生物分子[37]。內皮糖萼是一種多糖和蛋白質的混合物,在內皮細胞上創造了一個“不可濕性”的表面,這些多糖產生一種強烈的負離子電荷[38]。HBP包含一個絲氨酸蛋白酶折疊,暴露2個帶電的斑塊,一個堿性區域和一個酸性區域,其中堿性區域帶正電荷并作為肝素的結合位點[39]。從HBP的帶電斑塊的不同表面模式推斷[38],HBP的正電基團與內皮糖萼主要組成部分帶負電荷的糖胺聚糖側鏈形成離子相互作用是HBP結合在糖萼的主要原因。當血清中肝素濃度增高時,可競爭性地結合帶正電荷的HBP[40],使HBP脫離糖萼,進入血液循環,減少HBP被內皮細胞攝入內化的機會,減少HBP造成的內皮細胞激活和內皮損傷。其中肝素競爭強度與其在血液中的濃度呈正相關。

肝素可抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的降解,并可作為外源性糖胺聚糖參與修復糖萼結構,從而保護內皮細胞糖萼的降解,維持糖萼的功能。更關鍵的是肝素競爭性結合HBP,從而減少HBP在糖萼的錨定,減少HBP在內皮細胞的內化作用,從而減少血管內皮的損傷,減輕患者的炎癥與凝血功能紊亂,這解釋了肝素[41]保護血管內皮,減少血管通透性,減少白細胞和血小板異常凝集的機制。

4 結 論

綜上所述,糖萼是附著在血管內皮細胞表面的一種聚糖蛋白,并具有參與炎癥相關機制形成、抗凝抗栓、防止血細胞聚集和抗黏附作用,而膿毒癥凝血功能障礙或彌散性血管內凝血主要是由于內皮的進行性破壞和損傷,因此,糖萼的完整性在SIC中具有十分重要的意義。中性粒細胞攜帶的肝素結合蛋白作為一種參與炎癥進程的多功能蛋白,參與了膿毒癥血管內皮損傷和凝血功能障礙的病理過程。肝素結合蛋白作用于內皮細胞時,并非肝素結合蛋白與內皮細胞直接結合。肝素結合蛋白先與糖萼的硫酸肝素蛋白聚糖結合,進而通過內皮細胞的內化作用進入細胞內。因為蛋白結構和電荷原因,肝素可與糖萼競爭性結合肝素結合蛋白,并減少肝素結合蛋白被內皮細胞攝入內化的機會,從而減少肝素結合蛋白造成的內皮細胞激活和內皮損傷。從而減少血管通透性和白細胞、血小板異常凝集。

糖萼和肝素結合蛋白均參與了SIC發生發展的病理機制。肝素結合蛋白被內皮細胞內化前先與糖萼結合,糖萼是肝素結合蛋白在內皮細胞上的主要結合位點,為肝素結合蛋白直接作用于內皮細胞提供了一個“緩沖區域”。肝素的使用使得肝素結合蛋白可以脫離糖萼,對內皮細胞及糖萼起到保護作用,減輕了SIC的進展。目前對于肝素結合蛋白結合糖萼后參與SIC形成的分子機制仍有待進一步研究,明確該機制能為我們對膿毒癥患者凝血功能紊亂的監測、治療提供更多的思路和治療方法。