凝血機(jī)理概述、凝血組合物開(kāi)發(fā)及其在口腔護(hù)理產(chǎn)品中應(yīng)用

李立芬 邱淑婷 鄔鳳娟 李夢(mèng)蝶

(廣州星際悅動(dòng)股份有限公司,廣東 廣州 510610)

牙齦健康是口腔健康的基礎(chǔ)。隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步,人們面臨的工作、情感、 生活壓力越來(lái)越大,不規(guī)律的飲食習(xí)慣,不規(guī)范的口腔清潔操作,日益低下的機(jī)體免疫力,共同作用導(dǎo)致了各種牙齦問(wèn)題。

牙齦出血是牙齦炎主要臨床表現(xiàn),常作為口腔科門診就診原因。根據(jù)《第四次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)》調(diào)查報(bào)告數(shù)據(jù),牙齦出血檢出率:35～44歲年齡組 87.4%,人均有牙齦出血牙數(shù)為13.77顆;55～64年齡組 88.4%,人均牙齦出血牙數(shù)13.87顆;65～74年齡組 82.6%,人均有牙齦出血的牙數(shù)為11.25顆。牙齦出血困擾著我國(guó)相當(dāng)大比例的人群,開(kāi)發(fā)具有改善牙齦出血的口腔護(hù)理產(chǎn)品很有市場(chǎng)前景。

1 機(jī)體凝血系統(tǒng)

正常生理情況下,血液在循環(huán)系統(tǒng)中流動(dòng),一方面必須保持流體狀態(tài)不發(fā)生凝固,另一方面一旦創(chuàng)傷可通過(guò)正常止血機(jī)制達(dá)到止血目的;正常止血機(jī)制包括血管收縮、血小板反應(yīng)、凝血與抗凝系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)。凝血與抗凝保持動(dòng)態(tài)平衡,平衡失調(diào)及異常出血或者導(dǎo)致血栓形成。

圖1

血液凝固簡(jiǎn)稱凝血,是血液由流動(dòng)狀態(tài)變?yōu)槟z狀態(tài)的過(guò)程,它是止血功能的重要組成部分。凝血過(guò)程是一系列凝血因子被相繼酶解激活的過(guò)程,最終生成凝血酶,形成纖維蛋白凝塊。迄今為止,參與凝血的因子共有12個(gè)[1]。

根據(jù)凝血瀑布學(xué)說(shuō)[2,3],人體凝血可分為三個(gè)階段:凝血酶原激活物的形成階段、凝血酶原變?yōu)槟傅碾A段、在凝血酶作用下纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白階段。凝血過(guò)程通常分為內(nèi)源性凝血途徑、外源性凝血途徑、共同凝血途徑。內(nèi)源性凝血途徑指參加的凝血因子全部來(lái)自血液,臨床上常以活化部分凝血活酶時(shí)間反映體內(nèi)內(nèi)源性凝血途徑的狀況。外源性凝血途徑是指參加的凝血因子并非全部存在于血液中,還有外來(lái)的凝血因子參與止血,臨床上以凝血酶原時(shí)間測(cè)定來(lái)反映外源性凝血途徑的狀況;從因子X(jué)被激活至纖維蛋白形成,是內(nèi)源、外源凝血的共同凝血途徑。主要包括凝血酶生成和纖維蛋白形成兩個(gè)階段。

2 口腔護(hù)理產(chǎn)品常見(jiàn)凝血功效成分

2.1 中藥成分及作用機(jī)制

我國(guó)中藥資源十分豐富,有幾千年的臨床應(yīng)用。受環(huán)保、綠色生活理念影響,中藥牙膏在市場(chǎng)上的地位越來(lái)越高,種類也越來(lái)越多,例如云南白藥、田七、兩面針、草珊瑚等。中藥牙膏因藥性緩、毒副作用小,能有效改善各種口腔問(wèn)題,如抑菌、護(hù)齦、防齲等,深受消費(fèi)者喜愛(ài)。

三七是應(yīng)用最廣的止血中藥。據(jù)《本草新編》記載:“三七根,止血之神藥也?！比吒侵饕幱貌课?主要成分是皂苷,止血有效成分是水溶的三七素。三七素能增加血小板的數(shù)量,影響血小板的變形,縮短凝血酶原時(shí)間,釋放組胺刺激血管收縮,起到止血效果[4,5]。三七還具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用,為三七應(yīng)用于口腔護(hù)理產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

2.2 凝血酸作用機(jī)制

凝血酸又名氨甲環(huán)酸、傳明酸,于1954年發(fā)現(xiàn)其具有抑制纖維蛋白溶酶與纖維蛋白結(jié)合,從而抑制由纖溶酶所導(dǎo)致纖維蛋白分解,促進(jìn)機(jī)體凝血作用[6,7]。凝血酸是一種較強(qiáng)的止血?jiǎng)?在醫(yī)學(xué)臨床已廣泛應(yīng)用于減少術(shù)中或者術(shù)后的出血。凝血酸因其止血作用,近年也被用于護(hù)齦牙膏中,其中比較典型的為云南白藥牙膏。

2.3 多糖類止血成分及作用機(jī)制

多糖類物質(zhì)(如甲殼素、海藻酸鹽、淀粉類)具有良好的生物相容性、可降解性,已被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,其中應(yīng)用最廣泛的為甲殼素。甲殼素是熊甲殼類動(dòng)物中提取出來(lái)的天然多糖,結(jié)構(gòu)類似于植物纖維素,脫乙酰后為殼聚糖(脫乙酰殼多糖),殼聚糖具有廣泛的抗菌性和強(qiáng)黏附性,已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)并廣泛用于繃帶、敷料等止血材料。帶有陽(yáng)離子的殼聚糖可以與紅細(xì)胞表面陰離子相互作用, 使紅細(xì)胞在損傷部位迅速聚集,增強(qiáng)血小板向血管壁運(yùn)動(dòng),還可以激活、加速血小板黏附和聚集,從而形成血塊起到止血效果[8]。此外殼聚糖也可以通過(guò)血漿蛋白和凝血因子,修飾蛋白功能強(qiáng)化血凝塊加強(qiáng)止血,發(fā)揮良好的止血效果。

2.4 無(wú)極類止血成分及作用機(jī)制

沸石、粘土和高嶺土都是天然來(lái)源的多孔硅酸鹽礦物質(zhì),具有較強(qiáng)的吸水能力和良好的止血效果。無(wú)機(jī)類止血材料主要通過(guò)吸收血液中水分、濃縮凝血因子和血小板等血液成分發(fā)揮止血作用。沸石還可以通過(guò)釋放鈣離子激發(fā)凝血瀑布反應(yīng)[9]。無(wú)機(jī)類止血材料在口腔護(hù)理產(chǎn)品中應(yīng)用相對(duì)較少。

2.5 蛋白類類止血成分及作用機(jī)制

蛋白類止血材料主要包括膠原蛋白、明膠、纖維蛋白等[10]。膠原蛋白及其衍生物明膠是另一類常用于止血的生物活性材料。損傷發(fā)生后,膠原暴露在血液中,血小板通過(guò)膠原粘附、聚集和活化,啟動(dòng)凝血反應(yīng)。膠原蛋白類成分因其來(lái)源及成本控制,目前主要應(yīng)用于偏藥用口腔護(hù)理產(chǎn)品。

3 凝血組合物開(kāi)發(fā)

3.1 白及根提取物

白及作為一種珍貴中藥材,屬多年生陸地蘭科草本植物;白及又名白芨、白及粉、白及子,白及藥用價(jià)值較高,《神農(nóng)本草經(jīng)》顯示白及味苦澀,有消除癰腫,惡創(chuàng)出血的藥效[11]。《本草綱目》記載白芨連莖而升,性澀,有入肺止血,止外傷出血,生肌治瘡的藥效[12]。研究表明[13,14]白芨多糖可通過(guò)促進(jìn)活化凝血酶止血機(jī)制,縮短機(jī)體出血時(shí)間及凝血時(shí)間,具有較好的止血效果。

白及富含多糖、黃酮、皂苷等多種活性成分,具有止血、消炎、生肌、促進(jìn)組織再生等作用[15]。因此在口腔護(hù)理產(chǎn)品中具有重要的研究?jī)r(jià)值。

3.2 脫乙酰殼多糖

脫乙酰殼多糖來(lái)源于生物體,具有良好的相容性,是近年來(lái)止血性生物材料的研究熱點(diǎn)之一。脫乙酰殼多糖具有很多生理活性,如抗菌、止血、促傷口愈合[16～18]等,在醫(yī)藥、生物、化工、食品等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。

不同于常規(guī)的“瀑布理論”止血機(jī)制,脫乙酰殼多糖可在病學(xué)因子缺乏情況下誘導(dǎo)血塊形成,也可在肝素化條件下保持凝血活性。脫乙酰殼多糖帶正電荷,可通過(guò)離子作用力使帶負(fù)電荷紅細(xì)胞凝集起到凝血效果,還可以通過(guò)對(duì)血小板刺激作用、活化補(bǔ)體系統(tǒng)及其他血液成分促凝途徑實(shí)現(xiàn)止血效果[19]。

本研究選用采用獨(dú)立于凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)之外的靜電凝血機(jī)理實(shí)現(xiàn)凝血的脫乙酰殼多糖,復(fù)配通過(guò)活化凝血酶,作用纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白實(shí)現(xiàn)凝血的白及根提取物做凝血組合物,與機(jī)體機(jī)體自身的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)形成協(xié)同凝血作用,從而促進(jìn)凝血。用于在口腔護(hù)理產(chǎn)品中應(yīng)用及功效測(cè)試。

4 凝血組合物在口腔護(hù)理產(chǎn)品中應(yīng)用及功效測(cè)試

4.1 口腔護(hù)理產(chǎn)品中應(yīng)用

通過(guò)大量配伍性試驗(yàn)研究,將凝血組合物應(yīng)用于口腔護(hù)理產(chǎn)品,復(fù)配其他護(hù)齦功效組合物,研制開(kāi)發(fā)含有白及根提取物、脫乙酰殼多糖組合物的護(hù)齦口腔護(hù)理產(chǎn)品,并經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性考察,產(chǎn)品正常,符合牙膏、漱口水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。

4.2 功效驗(yàn)證

4.2.1 凝血酶時(shí)時(shí)間(TT)測(cè)定

測(cè)試機(jī)理:在血漿中加入標(biāo)準(zhǔn)化的凝血酶后血液凝固的時(shí)間。在共同凝血途徑中,所生成的凝血酶使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白,可用TT表示,是反映外源性凝血是否正常的重要指標(biāo),也是臨床常用指標(biāo)。

測(cè)試步驟:以無(wú)菌水作為溶劑,按一定比例將待測(cè)樣配成一定濃度的供試品溶液,以0.9%生理鹽水為空白對(duì)照,低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?豬血漿在3000rpm 4℃離心15min,制備血漿,低溫冷藏 備用;取待測(cè)血漿 0.1ml, 加入 0.1ml配置好的供試品樣品溶液,空白對(duì)照加入加入0.1ml生理鹽水混勻,37℃水浴孵育3min,加入凝血酶0.1ml混勻,立即啟動(dòng)秒表,記錄凝固時(shí)間,即為TT值。每個(gè)樣品重復(fù)10次,取平均值。

含凝血組合物牙膏/漱口水、陰性對(duì)照樣(生理鹽水組)、陽(yáng)性對(duì)照樣(市售宣稱凝血牙膏)TT測(cè)試數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 幾組樣品的TT值

根據(jù)凝血酶時(shí)間測(cè)試試驗(yàn)結(jié)果,含凝血酶的口腔護(hù)理產(chǎn)品TT值明顯小于陰性對(duì)照(生理鹽水),且小于市售宣稱有止血效果的護(hù)齦牙膏。試驗(yàn)結(jié)果表明,含凝血組合物的口腔護(hù)理產(chǎn)品能明顯縮短凝血酶時(shí)間,具有凝血效果。

4.2.2 抗凝血程度(BCI)測(cè)定

測(cè)試步驟:真空抽取1名健康志愿者外周血(兩周內(nèi)未服用任何抗凝血藥物),3.2%檸檬酸鈉抗凝,待用;取50ul待測(cè)樣加入到上述抗凝全血,37℃恒溫30min;取50ul 0.2M CaCl2加入上述抗凝全血,混勻,移液槍吸取復(fù)鈣抗凝全血10ul加入24孔板表面,37℃靜止孵育3、5、10min,加入1ml去離子水,振動(dòng)10min,使未凝固的紅細(xì)胞發(fā)生凝血;移液槍移取上清液到離心管,高速離心10min,取上清液200ul加入96孔板,用酶標(biāo)儀測(cè)量溶液在540nm波長(zhǎng)處的吸光度,重復(fù)測(cè)試3次,取均值。

BCI值計(jì)算公式如下,Ia表示復(fù)鈣抗凝全血與試樣接觸設(shè)定時(shí)間后溶液吸光度;Iw表示抗凝全血與去離子水混合后溶液吸光度。BCI越小,凝血效果越強(qiáng)。

試驗(yàn)測(cè)試了幾組原料/組合物和牙膏成品樣BCI值,測(cè)試結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖2 幾組凝血原料/組合物BCI值

圖3 幾組牙膏樣BCI值

根據(jù)抗凝血程度測(cè)試試驗(yàn)結(jié)果,組合物凝血效果優(yōu)于單一原料以及凝血酸凝血效果,含組合物牙膏凝血效果優(yōu)于含單一原料牙膏,且凝血效果相當(dāng)或優(yōu)于市售主打凝血效果牙膏。試驗(yàn)結(jié)果表明,凝血組合物有較好協(xié)同凝血作用,含組合物的牙膏具有很好的凝血效果。

4.2.3 消費(fèi)者測(cè)試

測(cè)試方法:本研究采用委外檢測(cè)方法,由具有相關(guān)資質(zhì)的第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)征集具有牙齦炎癥志愿者(受試者),使用含凝血組合物護(hù)齦牙膏每天早晚刷牙兩次,共使用14天,于使用測(cè)試樣品的1次、7天、14天后對(duì)消費(fèi)者牙齦狀態(tài)進(jìn)行問(wèn)卷填寫(xiě),如牙齦問(wèn)題減輕程度、牙齦腫痛減輕程度、牙齦出血減少情況等,進(jìn)而評(píng)估該牙膏護(hù)齦、凝血效果。

含凝血組合物牙膏對(duì)牙齦問(wèn)題改善結(jié)論如下:

80%受試者認(rèn)為,初次使用產(chǎn)品,牙齦出血得到改善,改善程度75%;

連續(xù)使用產(chǎn)品1周,95%受試者認(rèn)為牙齦出血有改善,改善程度87.3%

連續(xù)使用產(chǎn)品1周,90%受試者認(rèn)為牙齦問(wèn)題減輕,減輕程度86.7%;

連續(xù)使用產(chǎn)品1周,88%受試者認(rèn)為牙齦腫痛問(wèn)題有所改善,改善程度88.9%;

100%受試者認(rèn)為,使用產(chǎn)品兩周牙齦出血得到改善,改善程度95.2%;

100%受試者認(rèn)為,使用產(chǎn)品兩周牙齦問(wèn)題有所改善,改善程度90.1%;

100%受試者認(rèn)為,使用產(chǎn)品兩周牙齦腫痛有所改善,改善程度94.2%;

消費(fèi)者試驗(yàn)結(jié)果表表明,含凝血組合物的護(hù)齦牙膏具有較好的即時(shí)凝血效果,使用1周能有效改善牙齦脹痛、牙齦出血等牙齦問(wèn)題。

5 結(jié)論

使用脫乙酰殼多糖、白及根提取物的凝血組合物,復(fù)配其他護(hù)齦功效成分的口腔護(hù)理產(chǎn)品,能有效預(yù)防或者改善牙齦腫痛、牙齦出血等牙齦問(wèn)題。