細胞分裂周期蛋白42通過內皮-間充質轉化參與動脈型肺動脈高壓小鼠右心室纖維化*

王曉彤， 秦立龍， 王寒黎， 汪麗靜， 程玉生△

（1皖南醫學院第一附屬醫院心功能科，安徽 蕪湖 241000；2皖南醫學院第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，安徽 蕪湖 241000）

動脈型肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension， PAH）是一種進行性、復雜性和毀滅性的疾病，由多種致病因素或遺傳因素引起，最終導致右心衰竭和死亡［1-2］。由于發病機制尚未完全明了，目前現有的前列環素類似物、內皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶5 型抑制劑和可溶性鳥苷酸環化酶激動劑雖對PAH有一定療效，但不甚理想，患者預后很差［3-4］。因此，闡明PAH右心纖維化發生發展的分子機制，尋找有效的干預靶點對PAH右心纖維化和功能不全的治療具有重要意義。

內皮-間充質轉化（endothelial-mesenchymal transition， EndMT）是內皮細胞失去部分細胞特征而獲得間充質表型的過程，包括緊密連接缺失和細胞外基質生成增加，最初被觀察到是在胚胎發育中心臟墊層形態心內膜細胞分化的一個生理過程，在心血管生物學的背景下，EndMT 在各種疾病中發揮作用，包括動脈粥樣硬化、心臟瓣膜病、心臟纖維化和心肌梗死等［5-6］。

Rho GTP 酶是一種小蛋白（20~25 kD），屬于Ras相關蛋白超家族，其中研究最多的是RhoA、Rac-1 和細胞分裂周期蛋白42（cell division cycle protein 42，Cdc42）。Cdc42在全身各組織中均有表達，參與細胞增殖、遷移、分化等生理過程。既往研究顯示，角膜內皮細胞在成纖維細胞生長因子2 刺激下通過激活磷脂酰肌醇3-激酶導致EndMT，這一過程與Cdc42引起細胞肌動蛋白骨架改變有關［7］。RhoA 和Cdc42的缺失降低了α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）的表達［8］。然而，Cdc42 是否通過調節EndMT 過程參與PAH 小鼠右心纖維化及重構，目前尚不明確。

本研究通過血管內皮生長因子受體2 抑制劑司馬沙尼（semaxinib/SU5416）+缺氧（SU5416+hypoxia，SuHx）建立小鼠PAH 模型，探討Cdc42 在PAH 小鼠右心纖維化中的作用及其機制研究。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及分組

18 只C57BL/6 雄性小鼠購于浙江維通利華實驗動物技術有限公司，5~8 周齡，SPF 級，18~20 g，許可證號為SCXK（浙）2019-0001，倫理編號為2022236。將這18 只小鼠隨機分成3 組：常氧對照（normoxia control， NC）組、PAH 模型（SuHx）組和SuHx+ML141（Cdc4抑制劑）組，每組6只。所有存活小鼠在4周后用異氟烷麻醉處死。

2 主要試劑與儀器

SU5416（HY-1034）購自MedChemExpress；ML141（S7686）購自Selleck；磁珠分選套裝Mini & Midi-MACS Starting Kit（130-042-501）購自Miltenyi Biotec；內皮細胞培養液EGM-2（cc-3162）購自LONZA；α-SMA抗體（ab119952）和β-tubulin 抗體（ab6046）購自Abcam；β-actin 抗體（20526-1-AP）、Cdc42 抗體（10155-1-AP）和血小板內皮細胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1， PECAM-1/CD31）抗體（14395-1-AP）購自Proteintech；波形蛋白（vimentin）抗體（T55134）和血管內皮鈣黏蛋白（vascular endothelial-cadherin， VE-cadherin）抗體（T56599）購自Abmart；；鋅指蛋白Snail 抗體（3879S）購自Cell Signaling Technology。

Vevo 2100 超 聲系統（VisualSonics）；1.2F PV 3.5 mm導管和T400超聲血流儀（Transonic）。

3 主要方法

3.1 小鼠PAH 模型建立和分組處理 NC 組為常氧4周；SuHx組［9］為每周腹腔注射SU5416（20 mg/kg）一次，同時放置于低氧（10% O2）箱4 周進行PAH 造模；SuHx+ML141 組是在SuHx 造模基礎上，第2 周開始給予Cdc42 抑制劑ML141（8 mg/kg［10-11］）腹腔注射，每天一次，直至4周。

3.2 右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure， RVSP）測定和經胸超聲心動圖 所有小鼠在4周后進行RVSP 和超聲測定。使用脫毛膏將小鼠頸前及前胸部脫毛，暴露皮膚；裝好架鼠板、連接溫度傳感和麻醉管；用3%的異氟烷將小鼠麻醉后，以1.5%的濃度維持麻醉，并固定于小動物超聲儀加熱板的動物四肢固定裝置，維持動物體溫，根據測定層面，調節動物體位。使用Vevo 2100 超聲系統進行超聲心動圖，M-Mode 模式下以四腔心超聲切面測量測三尖瓣環平面收縮期位移（tricuspid annular plane systolic excursion， TAPSE）。小鼠心臟彩超完成后在次日測定RVSP，所有小鼠均用1%異氟烷混合在100%氧氣中，以1.0 L/min 的流速，使用麻醉機麻醉（期間注意觀察小鼠狀態，如呼吸頻率，避免小鼠麻醉過度甚至死亡）。小鼠固定于潔凈手術臺上，通過右頸外靜脈將Transonic 1.2F PV 3.5 mm 導管插入右心室。小動物生理儀AcqKnowledge 5.0 軟件通過Transonic T400 心室壓力容積及心輸出量測量模塊獲得血流動力學信號，待信號穩定后收集血流動力學參數至少3 min，并進行RVSP測定。

3.3 細胞培養 通過磁珠分選試劑盒分選心臟內皮細胞，在內皮細胞培養液中培養2~3 代，每48 h 更新一次培養液。細胞實驗分為三部分：（1）分為低氧誘導組（0、12、24、48 和72 h）和SuHx 組；（2）藥物抑制組，設置濃度梯度（0、2、5 和10 μmol/L）ML141組［12-13］；（3）分 為NC 組、低 氧72 h 組、低 氧72 h+ML141（10 μmol/L）組和NC+ML141（10 μmol/L）組。

3.4 心臟HE 和Masson 染色 取小鼠心臟，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm 切片。為了確定心肌肥厚和心臟纖維化的程度，采用HE染色進行心肌染色，采用Masson 三色染色法對心臟膠原纖維化區域進行染色，并在Leica DM 2500-LED 光學顯微鏡下和Leica DF000T 相機2.5 倍物鏡下進行檢查。用ImageJ 軟件（NIH）計算膠原容積分數（膠原面積/總面積）。

3.5 Western blot 已處理好的心臟組織和細胞樣本置于配制好的裂解液（VRIPA∶VPMSF∶V蛋白酶抑制劑=50∶1∶1）中裂解。將收集好的細胞裂解物置于4 ℃預冷的離心機以12 000×g離心30 min。收集上清液，并使用Pierce BCA 蛋白質分析試劑盒測定蛋白質濃度。將含有等量蛋白質的裂解物與5× loading 緩沖液混合，100 ℃煮10 min 使蛋白變性。將蛋白上樣于10% SDS 凝膠，進行電泳（80 V，130 min）分離，再電轉（250 mA，180 min）移到0.22 μm PVDF 膜上。電轉結束后將PVDF 膜置于封閉緩沖液（含5%脫脂牛奶的TBST，TBST 含0.1%吐溫20）中室溫孵育1 h。按實驗目的不同選用Ⅰ抗（α-SMA、β-actin、Cdc42、vimentin、β-tubulin、VE-cadherin、CD31 和Snail 抗體，均1∶1 000）4 °C 孵育過夜。回收Ⅰ抗，用TBST 洗滌膜3 次，每次10 min。加入相應Ⅱ抗（1∶4 000），室溫孵育1 h。孵育完成后，用TBST 洗膜3 次，每次10 min。向PVDF 膜加入已配制好的ECL 化學發光液，用Tannon全自動化學發光分析系統顯像。用ImageJ分析軟件對曝光好的條帶進行灰度分析。

4 統計學處理

采用SPSS 18.0 軟件進行統計學分析。數值均采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 SuHx組小鼠心臟組織Cdc42表達水平顯著升高

Cdc42 在SuHx 組小鼠心臟組織中表達較NC 組顯著升高（P<0.05），見圖1。

Figure 1.The expression of Cdc42 was increased in mouse heart tissues of SU5416+hypoxia （SuHx） group.Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs normoxia control （NC） group.圖1 Cdc42蛋白在SuHx組和NC組小鼠心臟組織中的表達

2 Cdc42 抑制劑ML141 可降低SuHx 組小鼠RVSP并增大TAPSE

SuHx 組 小 鼠RVSP ［（42.02±1.92） mmHg］較NC 組［（20.28±0.85） mmHg］顯著升高（P<0.01），TAPSE ［（0.67±0.06） mm］較NC 組［（1.03±0.08）mm］顯著減小（P<0.01）；與SuHx 組相比，SuHx+ML141 組小鼠RVSP ［（34.59±1.60） mmHg］顯著降低（P<0.01），而TAPSE ［（0.86±0.14） mm］顯著增大（P<0.01），見圖2。

Figure 2.Administration of Cdc42 inhibitor ML141 decreased right ventricular systolic pressure （RVSP； A） and increased tricuspid annular plane systolic excursion （TAPSE； B） in SU5416+hypoxia （SuHx） group.Mean±SD.n=6.*P<0.05， **P<0.01 vs normoxia control （NC） group； ##P<0.01 vs SuHx group.圖2 各組小鼠RVSP和心臟彩超TAPSE變化

3 Cdc421 抑制劑ML14 可減輕SuHx 組小鼠右心組織心肌細胞肥大及纖維化

右心組織HE 染色顯示，SuHx 組較NC 組右室心肌細胞肥大、排列紊亂；右心組織Masson 染色顯示，SuHx 組較NC 組右室（尤其是血管旁）纖維化顯著增加（P<0.01）；右心組織HE 和Masson 染色顯示，SuHx+ML141組較SuHx組心肌細胞肥大和纖維化顯著減輕（P<0.01），見圖3。

4 SuHx組和低氧72 h組內皮細胞出現EndMT

SuHx 組和低氧（3% O2）72 h 組內皮細胞的End-MT 較正常內皮細胞（低氧0 h 組）明顯增強，表現為EndMT 標志物CD31 和VE-cadherin 蛋白表達顯著降低（P<0.05），vimentin 和α-SMA 蛋白表達顯著升高（P<0.01），見圖4。

Figure 4.Endothelial-mesenchymal transition （EndMT） was observed in endothelial cells of SU5416+hypoxia （SuHx） group and hypoxia （72 h） group.A： the expression of EndMT-related proteins CD31 and viemntin in endothelial cells； B： the expression of EndMT-related proteins VE-cadherin and α-SMA in endothelial cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs normoxia control （NC） group.圖4 SuHx組和低氧72 h組內皮細胞出現EndMT

5 SuHx 組和低氧72 h 組內皮細胞Cdc42 蛋白表達均顯著升高，抑制Cdc42可緩解內皮細胞EndMT

SuHx組和低氧72 h組內皮細胞Cdc42蛋白表達水平較正常內皮細胞（低氧0 h 組）顯著升高（P<0.01），見圖5A。低氧不同時點Cdc42的表達與End-MT 相一致。設置梯度濃度（0、2、5 和10 μmol/L）的Cdc42 抑制劑ML141 處理，結果顯示在ML141 濃度為10 μmol/L 時緩解EndMT 作用最強，CD31 和VEcadherin 蛋白表達顯著升高，vimentin 和α-SMA 蛋白表達顯著降低（P<0.01），見圖5B、C。

Figure 5.The increased expression of Cdc42 in endothelial cells of SU5416+hypoxia （SuHx） group and hypoxia （72 h） group， and the inhibitory effect of Cdc42 inhibitor ML141 on endothelial-mesenchymal transition （EndMT） induced by hypoxia for 72 h.A： the protein level of Cdc42； B： the expression of EndMT-related proteins CD31 and vimentin after treatment with different concentrations of ML141； C： the expression of EndMT-related proteins VE-cadherin and α-SMA after treatment with different concentrations of ML141.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs normoxia control （NC） group； #P<0.05， ##P<0.01 vs hypoxia （72 h） group； △P<0.05， △△P<0.01 vs 10 μmol/L ML141 group.圖5 SuHx組和低氧72 h組內皮細胞Cdc42蛋白的高表達及ML141對EndMT的抑制作用

6 Cdc42抑制劑ML141改善內皮細胞EndMT形態

NC組內皮細胞呈鋪路石樣外觀；SuHx組和低氧72 h 組內皮細胞出現EndMT，內皮細胞呈紡錘形外觀；將預加了ML141 （10 μmol/L）的內皮細胞低氧誘導72 h（低氧72 h+ML141 組），紡錘形外觀的內皮細胞較低氧72 h組減少，即EndMT被抑制，見圖6。

Figure 6.Treatment with ML141 （10 μmol/L） reduced the spindle appearance of endothelial cells induced by EndMT in hypoxic （72 h） group（scale bar=200 μm）.The endothelial cells in normoxia control（NC） group showed a paving stone-like appearance， while those in hypoxia （72 h） group and SU5416+hypoxia （SuHx） group showed a spindle appearance.圖6 ML141對內皮細胞EndMT形態的影響

7 Cdc42抑制劑ML141抑制Snail蛋白表達

Snail 是EndMT 重要的轉錄蛋白。低氧72 h+ML141 組較低氧72 h 組的Snail 表達水平顯著下降（P<0.05），見圖7。

Figure 7.Treatment with ML141 （10 μmol/L） inhibited the expression of EndMT transcription protein Snail.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs normoxia control （NC） group； ##P<0.01 vs hypoxia （72 h） group.圖7 ML141對內皮細胞EndMT轉錄蛋白影響

討 論

PAH 最終導致右心纖維化和右心衰竭，心臟纖維化是許多終末期心血管疾病的共同病理表現和重要病理生理基礎。如何改善右心功能纖維化與功能不全是一直致力研究的方向。本研究利用SuHx 構建PAH 模型，旨在探討Cdc42 對PAH 右心纖維化的影響及其潛在機制。體內實驗顯示Cdc42在SuHx小鼠心臟組織中表達上調，抑制Cdc42 顯著減輕PAH小鼠右心纖維化，改善右心功能。在體外實驗中，Cdc42在低氧刺激的內皮細胞及SuHx內皮細胞表達上調，與EndMT 表達一致，給予Cdc42 抑制劑ML141處理后可以有效抑制EndMT。總之，這些數據表明Cdc42通過上調EndMT參與PAH后右心纖維化。

一般來說，用于PAH 新藥物治療臨床前實驗的常用動物模型有3 種：單氯萘啶肺損傷模型、慢性低氧性肺動脈高壓模型和SuHx 模型。SuHx 模型可導致嚴重PAH，并與嚴重PAH 患者的血管變化非常相似，目前已被廣泛使用。SU5416 作為一種血管內皮生長因子受體2 抑制劑，起初被用于腫瘤的治療，后在PAH 研究中顯示SU5416 產生的選擇壓力殺死了一些內皮細胞，并誘導常駐的內皮祖細胞轉分化為平滑肌樣細胞。與以往PAH 預防實驗不同的是，SU5416 會導致肺血管內皮細胞初始凋亡，凋亡信號會刺激剩余細胞出現超增殖狀態，并且在7 d內出現表型改變的內皮細胞［14］，利用抗凋亡抑制劑可以緩解上述狀態。本課題組前期在脂多糖模型中發現，肺血管內皮特異性敲除Cdc42可以抑制內皮細胞增殖和遷移，為避免早期SU5416 對內皮細胞凋亡信號的影響，本研究選擇在SU5416 作用1 周后用Cdc42抑制劑ML141 進行實驗。此外，SU5416 體外轉分化的人肺微血管內皮細胞表明，EndMT 可能是PAH 復雜血管形成的機制［15］，那么心臟血管內皮細胞是不是也存在EndMT？本研究顯示，SuHx 組小鼠出現右心纖維化，并且SuHx 和低氧刺激心臟內皮細胞均出現EndMT，說明SuHx 模型中不僅肺血管內皮細胞出現EndMT，心臟血管內皮細胞也出現EndMT。炎癥、低氧等情況會導致內皮細胞功能障礙，炎癥介質如白細胞介素1β 和轉化生長因子β（transforming growth factor-β， TGF-β）可誘導內皮細胞發生EndMT，病理性EndMT 參與壓力超負荷、糖尿病和心肌梗死等誘導的心肌纖維化［16-18］。心臟內皮細胞出現EndMT 可能與SuHx 模型中低氧和炎癥環境存在聯系，EndMT引起組織纖維化可能跟基質金屬蛋白酶有關。

Cdc42參與細胞的增殖、遷移、分化等生理過程，但大多數研究都是涉及與腫瘤相關的上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT），與調控EndMT相關的研究很少。我們的體內研究結果顯示，Cdc42 抑制劑ML141 可以減輕右心心肌纖維化，減少膠原沉積，改善SuHx 小鼠右心功能。進一步體外研究結果顯示，低氧刺激心臟內皮細胞后出現EndMT，而給予Cdc42 抑制劑ML141 可緩解EndMT，表明Cdc42可能通過調節EndMT參與PAH右心纖維化。Cdc42 是如何調控EndMT？缺氧和炎癥參與PAH 致病過程，炎癥因子TGF-β 可以激活Cdc42［19］。Cdc42 的關鍵靶標是一類肌動蛋白結合蛋白——肌動蛋白解聚因子/絲切蛋白（actin-depolymerizing factor/cofilin， ADF/cofilin）家族，該家族可以解聚肌動蛋白。Johnson 等［20］的報告表明，在表達和功能水平上，細胞骨架缺陷是骨形態發生蛋白受體II（bone morphogenetic protein receptor-II， BMPR-II）突 變 在BMPR-II 相關疾病肺動脈高壓中的重要分子機制。BMPR-II 與LIM 結構域激酶1（LIM domain kinase 1，LIMK1）形成復合體（Cdc42 協同作用），通過ADF/cofilin 的磷酸化轉換，將細胞外BMP 信號直接傳遞給肌動蛋白細胞骨架并導致細胞骨架重排［20-21］。本研究的顯微鏡觀察結果顯示，經歷EndMT 的內皮細胞逐漸改變其致密和結構良好（所謂的鵝卵石樣）的形狀，并獲得紡錘樣形態。這種變化的部分原因是細胞肌動蛋白絲的細胞骨架重排，其根底取向的喪失，細胞連接的不穩定和細胞外基質的重塑。此外，Cdc42還可能通過調節內質網釋放鈣離子，改變線粒體膜電位及線粒體呼吸鏈復合體I、III 和V 活性，調節內皮細胞的通透性和遷移，來調控EndMT［22］。本研究未進一步驗證Cdc42 通過何途徑調控EndMT，但證明了Cdc42可以通過EndMT參與心臟纖維化。

EndMT 是一個復雜的過程，其進展包括廣泛的中間表型和多個終點，會激活多種轉錄因子，最重要的是鋅指轉錄因子Snail、Slug、Zeb1 和Zeb2，以及基本的螺旋-環-螺旋轉錄因子Twist-1，這些轉錄因子作為內皮細胞和間充質細胞基因表達的抑制因子和（或）激活因子，導致特征性內皮標志蛋白表達缺失，以及間充質蛋白表達增加［23-24］。低氧誘導EndMT 出現轉錄抑制因子Snail 的表達上調，Snail 直接促進內皮細胞向間充質表型分化。因此，增強的Snail 表達進一步驗證了EndMT 的發生［25-26］。Snail 的上調不僅促進EndMT 產生大量成纖維細胞，還通過EndMT 細胞分泌的結締組織生長因子誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，從而加速心臟纖維化的發展。Snail可能是心臟纖維化的潛在靶分子，本實驗結果與既往實驗結果相似。抑制Cdc42 可緩解EndMT 而導致Snail 表達水平降低，進一步說明Cdc42 可能是PAH右心纖維化的潛在治療靶點。在癌癥相關的EMT中，Snail 通常位于其他4 個因子的上游，但在EndMT中的研究表明，所有轉錄因子都可以強烈地影響彼此的表達。EndMT 的結果是否由于這些因素的共同作用，或者是否有一個主導因素，仍有待闡明。

EndMT 在心臟纖維化中的作用已被許多研究證實，成纖維細胞是在心臟纖維化等生理和病理條件下產生成細胞外基質的主要細胞類型。在一項開創性的研究中，Zeisberg 等［27］利用譜系追蹤技術研究了實驗性誘導的心臟纖維化成纖維細胞的起源，主動脈束帶或同種異體移植排斥反應均可引起心臟纖維化，纖維化病變的定量分析顯示，高達35%的成纖維細胞具有內皮細胞起源。但也有少數研究持不同觀點，Moore-Morris 等［28］使用新型轉基因示蹤小鼠證明，在壓力超負荷誘導的心臟纖維化期間，心臟成纖維細胞很少來源于內皮間充質轉化細胞。其實在EndMT 病理過程中，內皮細胞出現EndMT 是復雜且受多種因素影響的過程。在與基因突變相關的疾病（如腦海綿狀血管瘤）中，突變基因（過度）表達使內皮細胞發生EndMT。在這些情況下，內皮細胞的EndMT 能力可能由突變基因的表達水平決定。然而，在非遺傳性疾病中，如細胞因子和生長因子的局部濃度、特定的細胞外基質結構或局部剪切應力條件，可能決定了一部分內皮細胞發生EndMT，但并非所有內皮細胞都是如此。另一方面，在譜系追蹤實驗中內皮標志物應仔細選擇。首先，內皮細胞是一個表達不同標志物亞群的群體，這些標志物亞群有時會以時間和組織依賴的方式上調或下調。炎癥或病理狀態下的組織可能傾向于過度表達內皮細胞標志物，導致假陽性。因此，需使用一個以上標志物來驗證。另外，基于患者來源細胞的新興器官芯片平臺將作為動物模型的補充來確定人類疾病過程中EndMT的具體機制。

目前我們的研究僅使用了Cdc42 抑制劑進行研究，后期可使用心臟內皮細胞Cdc42特異性敲除小鼠。同時本次實驗樣本量有限，未提取SuHx+ML141小鼠心臟內皮細胞進行實驗比較，后期實驗需增加樣本量。我們也未對EndMT 具體信號通路進行研究，后期進行進一步研究是必要的。

綜上所述，本研究證明了Cdc42 在體內和體外都是一種新型的EndMT 正調控因子。EndMT 在PAH 致右心纖維化及重塑的調控中起著重要作用，因此Cdc42 可能是治療PAH 后心肌纖維化的一個有前景的靶點。