基于PI3K/AKT/mTOR 信號通路探討野黃芩苷聯(lián)合虎杖苷抗慢性支氣管炎的作用機制*

王 祁， 趙 博， 高 璐， 李敏儀， 李 瑤， 張萌萌，衛(wèi)培峰，2， 王 斌， 李 敏△

（1陜西中醫(yī)藥大學，陜西 西安 712046；2陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 712099）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease， COPD）是不可逆氣流阻塞和有害環(huán)境刺激的持續(xù)炎癥［1］，是全球第三大致病率和致死率的主要因素。COPD 包括一些列疾病，慢性支氣管炎（chronic bronchitis， CB）和肺氣腫是其中典型，大多數(shù)病人同時患有這兩種疾病的某些特征。流行病學研究對CB 沒有固定定義，但普遍定義為連續(xù)2 年每年有至少3 個月的慢性咳嗽和痰液產(chǎn)生［2］。CB 臨床表現(xiàn)為肺功能極速下降、易引發(fā)下呼吸道感染。目前，導致CB 的發(fā)病機制尚不完全清楚，但主要涉及氣道黏液細胞化生、炎癥反應和肺氣腫等［3］。

CB 的臨床治療是聯(lián)合使用抗生素，而抗生素長期服用會產(chǎn)生耐藥性，同時有較多不良反應［4-5］。中醫(yī)藥在CB 和COPD 的治療歷史悠久、優(yōu)勢獨特。CB屬中醫(yī)學“咳嗽”“喘證”“痰證”“飲證”等范疇，分痰濕蘊肺、痰熱郁肺、肝火犯肺和肺陰不足四種證型［6］。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學對CB 的認識，臨床治療以清熱化痰、宣肺止咳平喘為主。周兆山教授［7］運用黃芩-虎杖（Huzhang， HZ）配伍治療COPD 具有顯著療效。課題組前期研究了黃芩莖葉（Huangqin Jingye，HQJY）的抗炎活性，證實HQJY 在肺系感染性疾病中具有重要作用，同時配伍HZ 可增強清熱、瀉肺和化痰止咳之力。因此本研究以HQJY和HZ的標志性成分野黃芩苷（scutellarin， Scu）和虎杖苷（polydatin，PD）作為研究對象，探究其抗大鼠CB 的藥效及作用機制，同時設置了桂龍咳喘寧片（Guilong Kechuanning tablet， GLKCN）作為陽性對照，驗證Scu聯(lián)合PD的療效，為后續(xù)研究呼吸系統(tǒng)疾病提供用藥參考資料。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1 藥物 HQJY-HZ 飲片購自亳州京晥中藥飲片廠；Scu 和PD 購自北京索萊寶科技有限公司（純度≥98%）；GLKCN 購自江西藥都仁和制藥有限公司；稱取干燥HQJY 和HZ飲片各50 g，混勻后加入1 L水浸泡30 min，武火煮沸后改文火煎煮50 min，過濾，再加入800 mL蒸餾水同法煎煮40 min，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀70 ℃濃縮至200 mL，過濾，制成含生藥量0.5 g/mL的濃縮液。

1.2 動物 90 只SPF 級SD 雄性健康大鼠，6~8 周齡，體質(zhì)量（200±20） g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（川）2020-030。動物倫理批準號：SUCMDL-2022041201。

1.3 試劑 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）購自Sigma；白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）、IL-6、IL-17A、IL-10 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和丙二醛（malondialdehyde， MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/AKT）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）抗體購自武漢博士德生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司。

1.4 儀器 全波長酶標儀（Thermo Fisher）；小型垂直電泳槽（Bio-Rad）；熒光定量PCR 儀（Roche）；轉(zhuǎn)膜儀（BioTek）。

2 實驗方法

2.1 動物分組、造模及給藥 適應性喂養(yǎng)1 周后，將大鼠隨機分為對照組、模型組、HQJY-HZ 水煎液（5 g/kg）組［8］、Scu （40 mg/kg）組［9］、PD （60 mg/kg）組［10］、高 劑 量（80 mg/kg+120 mg/kg） Scu+PD （Scu+PD-H）組、中 劑 量（40 mg/kg+60 mg/kg） Scu+PD（Scu+PD-M）組、低劑量（20 mg/kg+30 mg/kg） Scu+PD （Scu+PD-L）組和GLKCN （1 g/kg）組，每組10 只。于第1 天和第30 天用乙醚麻醉大鼠，采用氣管滴注法［11］構(gòu)建大鼠CB 模型。具體操作如下：插入進樣針至氣管入口1 cm 處，緩慢推注1 mL/kg 的LPS 溶液（1.5 mg/kg），輕搖，使LPS 均勻分布在大鼠兩肺；第2~60 天（第30 天除外），將大鼠置于120 cm×60 cm×50 cm 的自制煙熏箱中30 min，每次10 根香煙，每天2 次，每次煙熏間隔6 h，建立CB 模型。從造模第47天起灌胃給藥，藥物組給予相應劑量的藥物，對照和模型組灌胃等體積（10 mL/kg）生理鹽水。

2.2 動物處理 在末次給藥次日，采用10%水合氯醛麻醉大鼠后腹主動脈取血，靜置30 min，1 509×g離心15 min得到血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２裳蠹糸_頸部和胸腔，暴露氣管和肺組織，進行支氣管肺泡灌洗，合并兩次支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid， BALF），1 048×g離心10 min 后分離上清液和沉淀物待測。灌洗完后，取大鼠右肺組織計算濕/干（wet/dry， W/D）質(zhì)量比值；收集肺組織和支氣管于4%多聚甲醛中固定，用于肺組織和支氣管病理損傷觀察和組織評分；剩余肺組織封裝存于-80 ℃檢測相關(guān)mRNA和蛋白表達。

2.3 大鼠右肺組織W/D 質(zhì)量比值測定 將右肺組織處理后分別置于分析天平上精確稱量濕質(zhì)量和干質(zhì)量，計算質(zhì)量比，判斷肺組織水腫程度。

2.4 大鼠BALF中蛋白含量測定及白細胞和中性粒細胞計數(shù) 取BALF 上清液0.5 mL，按照BCA 蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白含量，取BALF沉淀物用生理鹽水稀釋至3 mL，168×g離心10 min 后吸取細胞懸液固定，干燥后瑞氏染色于顯微鏡下進行白細胞計數(shù)和中性粒細胞計數(shù)。

2.5 組織病理學觀察及評分 將每組于4%的多聚甲醛固定的樣品脫水后制備石蠟標本，切片后HE染色，在光鏡下觀察支氣管和肺組織損傷程度。在雙盲情況下采用Smith 評分方法［12］，觀察指標包括：（1）肺泡充血程度；（2）出血；（3）肺間質(zhì)中性粒細胞浸潤；（4）肺泡胞壁程度［13］。按評分指標對每張切片進行觀察及評分。

2.6 支氣管和血清炎癥因子測定 參照ELISA 試劑盒說明書操作步驟，測定大鼠支氣管和血清中IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-10和TNF-α炎癥因子含量。

2.7 SOD 活性和MDA 含量測定 按照試劑盒說明書檢測肺組織中SOD活性和MDA含量。

2.8 RT-qPCR 檢測肺組織中PI3K、AKT 和mTOR 的mRNA 表達 用Trizol 提取大鼠肺組織總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，以β-actin為內(nèi)參照，檢測PI3K、AKT和mTOR的mRNA 表達。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。PI3K 的上游引物序列為5'-AAGCAGGCAGCCGAGTATC-3'，下游引物序列為5'-TTTCGTTTCCCACCATTC-3'，擴增產(chǎn)物長度為89 bp；AKT的上游引物序列為5'-CTACGGTGCGGAGATTGTG-3'，下游引物序列為5'-AGAACGTCTTCATGGTGGC-3'，擴增產(chǎn)物長度為95 bp；mTOR 的上游引物序列為5'-GAGATACGCCGTCATTCCT-3'，下游引物序列為5'-GCTCAAACACCTCCACCTT-3'，擴增產(chǎn)物長度為97 bp；β-actin的上游引物序列為5'-TGTCACCAACTGGGACGATA-3'，下游引物序列為5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3'，擴增產(chǎn)物長度為165 bp。反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，45 個循環(huán)。擴增完后分析熔解曲線，采用2-ΔΔCt法計算各mRNA相對表達。

2.9 Western blot 檢測PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR 和p-mTOR 蛋白水平 用RIPA 裂解緩沖液提取蛋白并按照BCA 蛋白定量試劑盒說明書測定濃度，隨后將蛋白上樣、轉(zhuǎn)模、封閉，分別加入Ⅰ抗，于4 ℃下過夜；第2 天TBST 清洗后再加入Ⅱ抗，孵育、洗膜、顯影、掃描，使用ImageJ軟件計算條帶灰度值。

3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 軟件包進行統(tǒng)計學處理，應用GraphPad Prism 7 軟件作圖。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。用單因素方差分析進行組間檢驗，LSD 法進行檢驗后多重比較。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 大鼠右肺W/D質(zhì)量比值的變化

與對照組比較，模型組大鼠右肺W/D 質(zhì)量比值顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，GLKCN、HQJYHZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠右肺W/D 質(zhì)量比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），見圖1。

Figure 1.Wet/dry （W/D） mass ratio of the right lung of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group； *P<0.05， **P<0.01 vs model group.圖1 各組大鼠右肺濕/干質(zhì)量比值

2 大鼠BALF 中蛋白含量、白細胞數(shù)量和中性粒細胞數(shù)量的變化

與對照組相比，模型組大鼠BALF 中蛋白含量、白細胞數(shù)量和中性粒細胞數(shù)量均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠BALF 中蛋白含量、白細胞數(shù)量和中性粒細胞數(shù)量均顯著降低（P<0.05 或P<0.01）， 見表1。

表1 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量、白細胞和中性粒細胞數(shù)Table 1.Protein content， leukocyte count and neutrophil count in bronchoalveolar lavage fluid of the rats in each group（Mean±SD.n=10）

3 大鼠組織病理學觀察及評分

對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，細胞核大小均勻，肺泡腔清晰可見，無炎癥細胞浸出和肺泡壁增厚等病理學改變；模型組大鼠肺泡組織破壞，有紅細胞滲出，細胞核變形，可見大量中性粒細胞，肺泡壁明顯增厚，肺泡間質(zhì)有水腫、增生；與模型組比較，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組的炎癥細胞浸出明顯減少，肺間質(zhì)水腫明顯減輕，見圖2。

對照組大鼠支氣管上皮細胞排列整齊、支氣管管腔清晰、無杯狀細胞增生現(xiàn)象，支氣管通暢無阻塞；模型組大鼠支氣管上皮細胞排列錯亂，出現(xiàn)杯狀細胞增生現(xiàn)象，支氣管周邊有較多炎癥介質(zhì)浸潤，管腔有阻塞現(xiàn)象；GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠支氣管管周炎癥細胞浸潤和環(huán)節(jié)細胞增生現(xiàn)象均有不同程度減輕，見圖3。

Figure 3.Pathological changes of rat bronchi in each group （HE staining， scale bar=20 μm）.圖3 各組大鼠支氣管病理變化

4 大鼠BALF中IL-1β和IL-6含量的變化

與對照組比較，模型組大鼠BALF 中IL-1β 和IL-6 水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠BALF 中IL-1β和IL-6水平均顯著降低（P<0.01），見圖4。

Figure 4.The levels of IL-1β （A） and IL-6 （B） in bronchoalveolar lavage fluid of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group； **P<0.01 vs model group.圖4 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和IL-6水平

5 大鼠血清IL-17A、TNF-α和IL-10水平的變化

與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-17A 和TNF-α 水平顯著升高（P<0.01），IL-10 水平顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠血清中IL-17A 和TNF-α 水平均顯著降低（P<0.05 或P<0.01），IL-10 水平顯著升高（P<0.01），見圖5。

Figure 5.The levels of IL-17A （A）， TNF-α （B） and IL-10 （C） in serum of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group； *P<0.05， **P<0.01 vs model group.圖5 各組大鼠血清中IL-17A、TNF-α和IL-10水平

6 大鼠肺組織勻漿中MDA和SOD含量的變化

與對照組比較，模型組大鼠肺組織勻漿中MDA含量顯著增多（P<0.01），SOD 活性顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠肺組織勻漿中MDA 含量均顯著減少（P<0.01），SOD活性顯著升高（P<0.01），見圖6。

Figure 6.The MDA content （A） and SOD activity（B） in lung tissue homogenate of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group； **P<0.01 vs model group.圖6 各組大鼠肺組織勻漿中MDA含量和SOD活性

7 大鼠肺組織中PI3K/AKT/mTOR 的mRNA表達

與對照組比較，模型組大鼠肺組織中PI3K、AKT和mTOR 的mRNA 表達水平均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠肺組織中PI3K、AKT 和mTOR 的mRNA 表達水平均顯著降低（P<0.01），見圖7。

Figure 7.The mRNA expression of PI3K （A）， AKT （B） and mTOR （C） in lung tissues of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group； **P<0.01 vs model group.圖7 各組大鼠肺組織中PI3K、AKT和mTOR的mRNA表達

8 大鼠肺組織中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白水平

與對照組比較，模型組大鼠大鼠肺組織中p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR 蛋白水平均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠肺組織中p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR蛋白水平均顯著降低（P<0.01），其中Scu+PD-H組抑制PI3K、AKT 和mTOR 蛋白磷酸化的作用最為顯著（P<0.01），見圖8。

Figure 8.The protein levels of PI3K， p-PI3K， AKT， p-AKT， mTOR and p-mTOR in lung tissues of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group； **P<0.01 vs model group.圖8 各組大鼠肺組織中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白水平

討 論

CB 是全球范圍內(nèi)常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，是導致死亡和殘疾的主要原因之一［14］。CB 的特征是氣管和支氣管黏膜慢性炎癥和痙攣，導致呼吸困難、咳嗽、痰液產(chǎn)生等癥狀［15］。CB 屬中醫(yī)咳嗽、喘證范疇［16］。在LPS 誘導的CB 模型中，HQJY 配伍HZ 可治肺熱咳嗽、氣喘痰多。經(jīng)查閱相關(guān)資料，本研究采用HQJY 和HZ 中含量最高的有效成分Scu 和PD 進行后續(xù)大鼠實驗。

多種病理生理過程都有炎癥的存在，炎癥有助于機體抵御外來微生物的侵襲，但過度炎癥應激反應會加重機體的負擔。本研究通過免疫細胞計數(shù)來評估炎癥反應的嚴重程度［17］，結(jié)果提示CB 模型大鼠BALF 中白細胞和中性粒細胞升高，炎癥反應被激活，經(jīng)藥物干預后支氣管損傷減輕，炎癥水平降低，提示Scu 和PD 有抗炎效果，與既往研究相符。有研究表明Scu 和PD 可通過抑制IL-1β、IL-6、IL-17A 及TNF-α 的表達，同時促進IL-10 的表達，來減輕呼吸道炎癥而發(fā)揮肺保護作用［18-19］。因此，針對這些炎癥因子的調(diào)控是CB治療的一個潛在方向。

CB 常常會引起氧化應激，即機體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過多，而抗氧化能力相對下降［20］。本研究顯示在大鼠肺組織內(nèi)SOD活性和MDA含量在LPS滴注加煙熏后均顯著增加，而肺病理損傷狀態(tài)與氧自由基含量有關(guān)，在肺組織中SOD變化和MDA變化趨勢相悖，說明該疾病形成過程中不斷在消耗SOD 產(chǎn)生大量氧自由基，引起肺組織細胞脂質(zhì)過氧化，導致肺組織大面積損傷；給藥后氧化應激損傷均不同程度減輕。

PI3K/AKT/mTOR 信號通路是一條重要的炎癥通路，在炎癥反應、細胞增殖凋亡等方面發(fā)揮著重要作用［21］。PI3K作為細胞膜上的酶通過磷酸化作用將磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇三磷酸，從而激活下游的AKT 和mTOR 等信號分子［22］。炎癥因子通過細胞膜上的受體激活PI3K，繼而與AKT 的N 端PH 結(jié)構(gòu)域結(jié)合促進AKT 的磷酸化，促進細胞增殖、生長、代謝等生理過程［23］。mTOR 是AKT 的下游信號分子，可促進蛋白質(zhì)合成及細胞生長等過程［24］。研究表明，炎癥細胞可以通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路來調(diào)控多種炎癥因子，促進細胞增殖、分化和凋亡抑制，導致炎癥反應加劇［25-26］。此外，當組織受到氧化應激、損傷等刺激時，也會激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，引發(fā)炎癥反應和組織損傷，加劇CB 的發(fā)展［27］。本研究結(jié)果顯示，各種藥物均通過降低CB 大鼠肺組織中PI3K/AKT/mTOR 通路的活化，進而抑制炎癥反應，阻斷CB進一步發(fā)展。

綜上所述，Scu 聯(lián)合PD 可抑制CB 大鼠的炎癥反應，其抗炎作用與抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路活化，減輕氧化應激反應，抑制炎癥因子IL-17A、TNFα、IL-1β和IL-6有關(guān)。然而，單獨提高Scu或PD的劑量，且在無毒副作用的范圍內(nèi)，是否可以達到Scu 和PD聯(lián)用的效果，尚待研究。