蟲草素調節MAPK/AP-1信號通路對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織損傷的影響

陳才偉 陳家亮 李華娟 方芳 文方玲

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是由多種原因引起的慢性肺部炎癥性疾病,它的特征是不可逆的氣流受限,與肺部吸入香煙煙霧等顆粒物質有關[1]。研究發現肺部及全身性炎癥反應、氧化應激、氣道重塑是引起COPD的主要誘因[2]。因此抑制炎癥,改善氧化應激是治療COPD的關鍵著力點。蟲草素(Cordycepin,Cor)是天然藥材冬蟲夏草的主要生物活性成分,具有廣泛的生物活性,如抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤等[3]。有研究發現,Cor可以通過抑制nuclear factor kappa-B(NF-κB p65)炎癥通路來改善膿毒癥小鼠肺損傷,還可以改善腎臟組織因ROS過量產生的氧化應激損傷[4-5]。目前臨床上對于Cor治療COPD的機制尚不明確,因此本研究基于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen- activated protein kinase,MAPK)/激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)信號通路,探討Cor對于COPD可能的治療機制,為COPD治療尋找新的治療靶點。

資料與方法

一、材料

1 實驗動物 SD大鼠60只,6～8周齡,體質量200-220g,購買自廣州銳格生物科技有限公司,許可證號:SCXK(粵)2021-0059。所有大鼠均飼養于本院動物實驗中心,適應性喂養一周,觀察無異常后,用于后續實驗。

2 試劑與儀器 Cor標準品(HPLC≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司;N-乙酰半胱氨酸(NAC)片(國藥準字H20080326)購自中國海南海邦藥業有限公司;LTB4、TNF-α、IL-6的ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司;HE染色試劑盒、MDA、SOD、GSH-Px微量法試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;抗體p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38、C-jun、C-fos、GAPDH均購自艾博抗(上海)貿易有限公司。

儀器:多功能酶標儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;光學顯微鏡購自日本奧林巴斯。

二、方法

1 造模及分組 利用煙熏聯合脂多糖滴入氣管的方法造模[6]:將大鼠置于煙熏箱中,使用香煙煙熏5 w,每天早晚各1 h,煙熏時間間隔12 h。在煙熏的第1天和第15天在大鼠氣管內滴入0.2 mL脂多糖,造模結束后,以肺組織出現明顯病理損傷及肺功能下降為造模成功標準。將造模大鼠隨機分為模型組(COPD)、蟲草素低、中、高劑量組(Cor-L、M、H,10、20、50mg/kg,用0.5%的羧甲基纖維素鈉制備成相應濃度的混懸液)[7]、陽性對照組(NAC,0.5g/kg,用0.5%的羧甲基纖維素鈉制備成混懸液)[8],另設置正常培養的大鼠為對照組(NC)。造模后,Cor-L、M、H組、NAC組分別按照對應劑量灌胃Cor和NAC的0.5%的羧甲基纖維素鈉混懸液,COPD組和NC組給予0.5%的羧甲基纖維素鈉灌胃,一天一次,連續給藥2周。

2 肺功能檢測 末次給藥24 h后,麻醉大鼠,固定于手術臺,利用大鼠肺功能儀,檢測肺功能指標,包含呼氣峰流速(peak expiratory flow,PEF)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)。

3 樣本采集 肺泡灌洗液:肺功能檢測完畢后,麻醉大鼠,手術暴露氣管,結扎右側氣管,使用注射器向左肺中注入PBS緩沖液,反復灌洗3次,合并灌洗液,離心分別收集上清和細胞沉淀備用。

肺組織:收集肺泡灌洗液完畢后,處死大鼠,手術暴露肺部,無菌完整剝離肺組織,用于肺部病理學變化檢測、氧化應激、蛋白檢測。

4 大鼠肺組織病理學變化檢測 取方法3中保留的右肺中葉,PBS沖洗干凈后,使用4%多聚甲醛固定后,脫水、浸蠟、包埋、切片后,使用HE染色試劑盒進行染色,光學顯微鏡下觀察拍照,并進行病理學評分,評分標準[9](見表1)。

表1 肺組織病理評分標準

5 大鼠肺泡灌洗液白細胞種類觀察 取方法3中保存的肺泡灌洗液中的細胞沉淀,加入PBS混勻后,取適量細胞懸液在顯微鏡下觀察細胞數目。再取細胞懸液制備細胞涂片,染色后對巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞進行分類計數。

6 大鼠肺泡灌洗液炎性因子水平 取方法3中保存的肺泡灌洗液上清,根據ELISA試劑盒檢測上清中TNF-α、IL-6和LTB4水平。

7 大鼠肺組織氧化應激指標檢測 取方法3中保留的右肺上葉,液氮研磨后,勻漿離心,收集上清,根據微量法試劑盒檢測肺組織中MDA、SOD、GSH-Px水平。

8 Western Blot檢測蛋白表達 取方法3中保留的右肺下葉,剪碎,加入蛋白裂解液,超聲破碎后,離心收集上清,BCA法測定蛋白濃度后,取適量蛋白上樣、電泳、轉膜、封閉,完成上述步驟后,洗膜,加入一抗p-ERK(1 ∶1 000)、ERK(1 ∶1 000)、p-JNK(1 ∶1 000)、JNK(1 ∶1 000)、p-p38(1 ∶1 000)、p38(1 ∶1 000)、C-jun(1 ∶1 000)、C-fos(1 ∶1 000),內參GAPDH(1 ∶1 000),4℃過夜后,洗膜加入二抗(1 ∶1 000),室溫孵育1 h后,化學發光法顯影,目的蛋白與內參的條帶灰度值之比表示為蛋白相對表達量。

三、統計學分析

采用SPSS 26.0進行數據分析,計量資料用平均值±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩間比較采用SNK-q檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、Cor對大鼠肺功能的影響

如(表2)所示,與NC組比較,COPD組大鼠肺功能指標PEF、FVC值均顯著下降(P<0.05);與COPD組比較,Cor各劑量組、NAC組大鼠肺功能指標PEF、FVC值均顯著上升(P<0.05);NAC組與Cor-H組比較,上述指標無顯著差異(P>0.05)。

表2 各組大鼠肺功能指標比較

二、Cor對大鼠肺組織病理學變化的影響

如(圖1)所示,NC組大鼠肺組織結構完整,肺泡輪廓清晰,未見炎性細胞浸潤,肺泡間隔正常,大小正常;與NC組比較,COPD組大鼠肺組織結構破壞,肺泡間隔增厚,肺泡腫大,炎性細胞浸潤明顯,病理學評分顯著升高[(0.26±0.04)分vs(5.45±0.63)分,P<0.05];Cor各劑量組隨著藥物濃度增大,肺泡腫大、炎性細胞浸潤等病理現象逐漸減輕;NAC組呈現出與Cor-H組相當程度的病理損傷好轉現象;與COPD組比較,Cor各劑量組、NAC組大鼠肺組織病理學評分顯著降低[(5.45±0.63)分vs(4.69±0.55)分、(3.82±0.45)分、(2.71±0.39)分、(2.75±0.42)分,P均<0.05]。

圖1 HE染色觀察大鼠肺組織病理學變化(HE×200)

三、Cor對大鼠肺泡灌洗液白細胞數目的影響

如(表3)所示,與NC組比較,COPD組大鼠肺泡灌洗液中白細胞數目、中性粒細胞比率顯著上升,巨噬細胞比率、淋巴細胞比率顯著下降(P<0.05);與COPD組比較,Cor各劑量組、NAC組大鼠肺泡灌洗液中白細胞數目、中性粒細胞比率顯著下降,巨噬細胞比率、淋巴細胞比率顯著上升(P<0.05);NAC組與Cor-H組比較,肺泡灌洗液白細胞數目無顯著差異(P>0.05)。

表3 各組大鼠肺泡灌洗液白細胞數目比較

四、Cor對大鼠肺泡灌洗液炎性因子水平的影響

如(表4)所示,與NC組比較,COPD組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和LTB4水平均顯著上升(P<0.05);與COPD組比較,Cor各劑量組、NAC組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和LTB4水平均顯著下降(P<0.05);NAC組與Cor-H組比較,肺泡灌洗液炎性因子水平無顯著差異(P>0.05)。

表4 各組大鼠肺泡灌洗液炎性因子水平比較

五、Cor對大鼠肺組織氧化應激的影響

如(表5)所示,與NC組比較,COPD組大鼠肺組織中MDA含量顯著上升,SOD、GSH-Px活性顯著下降(P<0.05);與COPD組比較,Cor各劑量組、NAC組大鼠肺組織中MDA含量顯著下降,SOD、GSH-Px活性顯著上升(P<0.05);NAC組與Cor-H組比較,肺組織MDA、SOD、GSH-Px水平無顯著差異(P>0.05)。

表5 各組大鼠氧化應激水平比較

六、Cor對大鼠肺組織中蛋白表達的影響

為了確定Cor對于是否通過MAPK信號來影響AP-1表達,檢測了MAPK相關蛋白ERK、JNK、p38MAPK(p38)及其磷酸化水平,以及AP-1相關蛋白C-jun、C-fos蛋白表達。(如圖2、表6)所示,與NC組比較,COPD組大鼠肺組織中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38、C-jun、C-fos蛋白表達顯著上升(P<0.05);與COPD組比較,Cor各劑量組、NAC組大鼠肺組織p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38、C-jun、C-fos蛋白表達顯著下降(P<0.05);NAC組與Cor-H組比較,肺組織MAPK、AP-1相關蛋白表達無顯著差異(P>0.05)。

圖2 大鼠肺組織中MAPK/AP-1信號通路蛋白條帶

表6 各組大鼠肺組織中蛋白表達水平比較

討 論

既往研究表明氧化應激,炎癥反應,蛋白酶/抗蛋白酶失衡是COPD發病過程中的重要參與者,ROS過量會導致肺組織發生氧化應激,導致肺損傷的發生,促進肺組織炎癥反應,使炎性細胞浸潤肺部,釋放大量炎癥因子,肺功能也隨之下降[10]。在本研究結果中,COPD大鼠肺組織出現肺泡腫大變形和炎性細胞浸潤等病理學變化,并且肺功能下降,提示造模成功。

COPD的特征是氣道慢性炎癥,導致肺實質(肺氣腫)破壞和肺功能下降,而活性氧過量會幫助COPD擴大炎癥反應,長期炎癥刺激又會導致炎癥細胞(例如中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞)浸潤,然后釋放多種炎性細胞因子如IL-6、TNF-α等加劇肺部炎癥反應[11-12]。COPD通常與吸煙有關,香煙煙霧在COPD發生發展過程中,作為外源性的活性氧,使患者氣道免疫失調,產生炎癥[13]。ROS過量會導致COPD患者體內MDA大量產生,抗氧化物質如SOD、GSH耗盡,導致抗氧化系統失衡[14]。在本研究中,COPD組大鼠出現高氧化應激狀態,MDA含量上升,SOD、GSH-Px活性下降;并且肺泡灌洗液中中性粒細胞水平顯著上升,炎性因子TNF-α、IL-6和LTB4水平也顯著上升,表現在HE染色中的結果是肺組織炎性細胞浸潤明顯,說明香煙和LPS聯合使COPD大鼠產生了氧化應激,并且因此導致了炎性反應的加劇。Cor具有抗炎和抗氧化活性,研究發現它可以減輕棕櫚酸(PA)誘導的細胞毒性,抑制活性氧ROS的產生和炎癥反應[15]。在本研究中,經過不同劑量Cor處理后,大鼠肺功能上升,氧化應激狀態得到改善,炎性細胞因子水平下降,中性粒細胞浸潤減少,且高劑量Cor對COPD大鼠肺功能的保護作用顯著優于低、中劑量Cor,說明Cor以劑量依賴性方式抑制了氧化應激和炎癥反應,改善了COPD大鼠肺功能。

研究發現ROS介導細胞炎癥通路如MAPK/AP-1通路激活參與炎性疾病的發展,在LPS誘導的小鼠急性肺損傷中,抑制MAPK/AP-1通路表達可以改善小鼠的肺部炎癥[16]。MAPK的激活可以誘導炎癥轉錄因子NF-κB、AP-1易位到細胞核中并增加TNF-α和IL-6的釋放,MAPK包含多個成員,如細胞外調節激酶(ERK1/2)、C-Jun N末端激酶(JNK)、p38,AP-1包括C-Fos和C-Jun異二聚體,是介導多種生物過程的轉錄因子[17-18]。紫外線輻射產生的活性氧ROS是導致光損傷的主要因素,通過藥物活性成分抑制MAPK/AP-1蛋白磷酸化水平,可以抑制炎性細胞因子的釋放,改善紫外線輻射的皮膚光損傷[19]。NAC是一種在臨床上用于治療COPD的黏液溶解劑,可通過提高機體的抗氧化能力,減輕患者的痰黏液癥狀,改善肺功能,且NAC具有顯著的抗炎活性[20-21]。研究顯示,NAC能夠通過阻斷NF-κB信號通路抑制COPD大鼠肺組織炎癥反應[22]。白學敏[23]等人發現,NAC能通過降低p-JNK/JNK、p-p38/p38、p-ERK/ERK表達抑制MAPK信號通路,抑制氣道黏液高分泌狀態,改善COPD大鼠肺功能。在本研究中,給予NAC干預后,COPD大鼠肺損傷明顯改善,這與以往的研究[22-23]結果一致;經過Cor處理后,各組大鼠肺組織MAPK/AP-1蛋白磷酸化水平下降,改善了香煙和LPS聯合產生氧化應激,抑制了炎癥反應,改善了COPD大鼠的肺損傷;且Cor對COPD大鼠肺損傷的保護作用與NAC相似,說明Cor具有治療COPD的潛力。

綜上所述,Cor可以抑制MAPK/AP-1信號通路,減輕炎癥反應和氧化應激,改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織病理損傷。關于上游激活MAPK/AP-1信號通路以及該通路對下游炎性轉錄因子的調節機制,有待進一步研究。