肉桂醛調節SDF-1/CXCR4軸對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥的影響

高小梅 何佳穎 朱圓圓 張紅霞

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種慢性呼吸系統疾病,其癥狀為咳嗽、咳痰、喘息和不完全可逆的氣流受限,后期會出現慢性肺心病等并發癥。目前使用的抗生素和激素類藥物只能暫時緩解癥狀,且可能會出現副作用[1-2]。因此,尋找新的策略和治療藥物非常重要。基質細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)是趨化細胞因子超家族的關鍵成員,在多種受損的組織中高表達[3]。SDF-1可以與其受體C-X-C趨化因子受體4型(C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4)結合參與炎癥反應和組織修復等過程,已知SDF-1/CXCR4信號被抑制能夠阻礙COPD的進展[4-5]。肉桂醛(cinnamaldehyde,CA)是肉桂的主要活性成分,具有抗菌、抗炎和抗氧化等生理活性[6]。研究稱CA可以保護脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的小鼠急性肺損傷,也可以緩解高脂肪飲食誘導的動脈粥樣硬化[7-8]。但CA在COPD中的作用還未了解。因此,本研究旨在探討CA對COPD大鼠肺損傷的保護作用及其中的具體機制。

資料與方法

一、材料

1 動物 SPF級Wistar大鼠,6周齡,(160±20)g,購自于遼寧長生生物技術股份有限公司,許可證號:SCXK(遼)2020-0002。實驗前將所有大鼠置于溫度26℃,濕度60%的環境中飼養。本研究經動物倫理委員會批準(K202211-09)。

2 主要試劑 肉桂醛(HPLC≥98%,四川省維克奇生物科技有限公司);氨茶堿片(安徽國正藥業股份有限公司,國藥準字H20067772);AMD3100(貨號:HY-10046,美國MedChemExpress公司);蘇木素-伊紅(HE)染色液、劉氏染色液(貨號:SY2022、YT8870,北京伊塔生物科技有限公司);白三烯B4(LTB4)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒(貨號:EK-R36908、EK-R36902、EK-R36877、EK-R38696,上海酶研生物科技有限公司);SDF-1、CXCR4兔單抗(貨號:ab155090、ab124824,英國abcam公司);山羊抗兔二抗(貨號:XY0650,上海信裕生物科技有限公司)。

二、方法

1 大鼠COPD模型的建立和分組處理 將所有大鼠隨機分為對照組、模型組、氨茶堿組(陽性藥物)、AMD3100組(CXCR4抑制劑)、CA低劑量組、CA高劑量組,每組10只。除對照組,其余組均參照文獻[9]方法使用香煙煙熏和LPS注射組合建立COPD大鼠模型。在造模的第1 天和第14 天,麻醉大鼠并進行氣管注射200 μg用生理鹽水溶解的LPS,在第2～13 天和15～60天將大鼠置于透明的密閉容器中進行煙熏,9支香煙/次,2 h/次,2次/天。從第31 天開始,氨茶堿組灌胃54 mg/kg的陽性藥物氨茶堿混懸液[10],AMD3100組灌胃1 mg/kg的CXCR4抑制劑AMD3100[11];CA低、高劑量組分別灌胃10 mg/kg、40 mg/kg的CA[7],對照組和模型組均灌胃等量的生理鹽水,1次/天,持續30 天。

2 肺功能評估 給藥結束后,用1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,使其仰臥位置于密閉體描箱內,其呼吸借助一端與插管連接,另一端與體描箱外動物呼吸機的皮管連接,并使大鼠適應5 min。然后用動物肺功能檢測儀檢測大鼠功能殘氣量(FRC)、呼氣峰流量(PEF)、第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)及第0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量的百分比(FEV0.3/FVC)。

3 樣本采集 將大鼠麻醉后,打開胸腔,對大鼠的右支氣管進行結扎,然后用1 mL生理鹽水灌洗左肺支氣管肺泡,重復3次,收集支氣管肺泡灌洗液(BALF),并在4℃下1500 r/min離心10 min,分別收集沉淀和上清用于細胞計數和ELISA實驗。然后將大鼠處死摘取大鼠右肺組織,用預冷的PBS沖洗干凈,在每組中隨機選取5個右肺組織置于4%多聚甲苯中固定,剩余右肺組織凍存于-80℃用于蛋白檢測。

4 HE染色觀察肺組織病理學變化 將方法3中固定過夜的右肺組織石蠟包埋并切片,然后用二甲苯脫蠟,梯度酒精脫苯,HE染液染色,蒸餾水沖洗后用梯度乙醇脫水,二甲苯透明,最后中性樹脂封片。在光學顯微鏡下觀察肺組織的病理形態。

5 BALF中的細胞計數 將方法3中收集的BALF的細胞沉淀用1 mL PBS重懸,用標準血細胞計數器計數BALF中的白細胞總數。通過細胞離心制備涂片,用劉氏染色液染色,并根據標準形態學標準,對中性粒細胞和淋巴細胞進行計數。

6 ELISA檢測BALF中炎癥因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平 將方法3中保存的BALF上清液取出置于冰上溶解,然后分別根據ELISA試劑盒的操作步驟檢測BALF中LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

7 Western Blot檢測肺組織SDF-1、CXCR4蛋白表達 將方法3中凍存的右肺組織取出,加蛋白裂解液置于玻璃勻漿器中,勻漿后離心收集上清,用BCA測定蛋白濃度。然后用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉移至PVDF膜上。用5% BSA封閉液浸泡PVDF膜,4℃孵育過夜,隨后加入一抗稀釋液(SDF-1比例1 ∶10 000,CXCR4比例1 ∶1 000),室溫孵育2 h后加入羊抗兔IgG二抗稀釋液(1 ∶500)中,室溫孵育2 h,最后用ECL顯影。以GAPDH為內參蛋白,用凝膠成像儀和Image J軟件觀察并分析蛋白條帶灰度值。

三、統計學分析

結 果

一、各組大鼠肺功能評估結果

與對照組相比,模型組大鼠FRC值升高,PEF、FEV0.3及FEV0.3/FVC值降低(P<0.05);與模型組相比,氨茶堿組、AMD3100組和CA低、高劑量組大鼠FRC值降低,PEF、FEV0.3及FEV0.3/FVC值升高(P<0.05),且CA高劑量組與氨茶堿組和AMD3100組均無顯著差異(P>0.05)(見圖1)。

圖1 各組大鼠肺功能評估 A:各組大鼠功能殘氣量;B:各組大鼠呼氣峰流量;C:各組大鼠第0.3秒用力呼氣容積;D:各組大鼠第0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量的百分比;與對照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與氨茶堿組相比,cP<0.05;與AMD3100組相比,dP<0.05

二、各組大鼠肺組織病理形態

與對照組相比,模型組大鼠肺泡間隔變窄并斷裂,肺泡擴大成肺大皰,支氣管道周圍明顯炎癥細胞浸潤;氨茶堿組、AMD3100組和CA低、高劑量組肺泡結構恢復,肺泡輕微擴張,炎癥細胞浸潤減少(見圖2)。

圖2 HE染色檢測各組大鼠肺組織的病理變化(×200)

三、各組大鼠BALF中白細胞總數、中性粒細胞和淋巴細胞數

與對照組相比,模型組大鼠BALF中白細胞總數、中性粒細胞和淋巴細胞數增加(P<0.05);與模型組相比,氨茶堿組、AMD3100組和CA低、高劑量組大鼠BALF中白細胞總數、中性粒細胞和淋巴細胞數降低(P<0.05),且CA高劑量組與氨茶堿組和AMD3100組均無顯著差異(P>0.05)(見圖3)。

圖3 各組大鼠BALF中白細胞總數、中性粒細胞和淋巴細胞數

四、各組大鼠BALF中LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平

與對照組相比,模型組大鼠BALF中LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α含量增加(P<0.05);與模型組相比,氨茶堿組、AMD3100組和CA低、高劑量組大鼠BALF中LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低(P<0.05),且CA高劑量組與氨茶堿組和AMD3100組均無顯著差異(P>0.05)(見圖4)。

圖4 各組大鼠BALF中LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平

五、各組大鼠肺組織中SDF-1、CXCR4蛋白的表達

與對照組相比,模型組大鼠肺組織中SDF-1、CXCR4蛋白表達升高(P<0.05);與模型組相比,氨茶堿組、AMD3100組和CA低、高劑量組大鼠肺組織中SDF-1、CXCR4蛋白表達降低(P<0.05),且CA高劑量組與氨茶堿組和AMD3100組均無顯著差異(P>0.05)(見圖5,6)。

圖5 各組大鼠肺組織中SDF-1、CXCR4蛋白表達條帶

圖6 各組大鼠肺組織中SDF-1、CXCR4蛋白相對表達量

討 論

COPD是由各種原因引起的慢性異常肺部炎癥反應,受遺傳和環境因素影響,其特征是進行性加重和不完全可逆的氣流阻塞,死亡率較高[12]。肺功能檢查和肺組織病理改變是COPD的診斷標準,FRC、FEV1/FVC和PEF均反映氣流阻塞情況,但由于大鼠呼吸頻率較快,因此用FEV0.3/FVC來代表一秒的頻率[13]。本研究通過煙熏和LPS注射聯合建立大鼠模型,結果發現模型組大鼠FRC值增加,FEV0.3/FVC及PEF值降低,此外,HE染色也顯示出大鼠肺泡間隔變窄并斷裂,肺泡擴大成肺大皰,支氣管道周圍明顯炎癥細胞浸潤,提示大鼠出現慢性阻塞性通氣障礙,COPD模型建立成功。當陽性藥物氨茶堿和CA不同劑量組干預后,大鼠FRC值降低,FEV0.3/FVC及PEF值升高,且肺組織中肺泡結構逐漸恢復,肺泡輕微擴張,炎癥細胞浸潤減少。這些結果揭示了CA可以減輕氣道阻塞,有效改善肺功能病理性損傷。

已知有害氣體和顆粒(如吸煙)引起肺部異常炎癥反應是COPD的主要危險因素[14]。肺部炎癥可使不同肺腔室中的白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞顯著增加,并釋放多種介質,如LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子及其他炎癥介質,進而導致肺結構損傷和炎癥反應,因此促炎因子的水平可反映COPD的嚴重程度[15]。本研究結果顯示,模型組大鼠BALF中白細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數量以及LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量較對照組升高;而氨茶堿組和CA不同劑量組大鼠BALF中白細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數量及LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量較模型組降低。由此表明了CA可以抑制COPD大鼠的炎癥反應,減輕肺組織炎性損傷,進而阻止COPD的發展,其作用與陽性藥物氨茶堿一致。

SDF-1,也稱為CXCL12,是CXCR4的主要特異性配體,在患有炎癥、缺血、缺氧和血管生成的生物體中顯著上調,說明SDF-1可能是組織修復和再生所必需的[16]。而CXCR4在多種造血細胞、炎癥細胞和非造血祖細胞中表達,其被發現與多種疾病有關。在動脈粥樣硬化的發病機理中,CXCR4參與動脈壁的慢性炎癥,其特征在于趨化因子介導的白細胞流入[17-18]。研究顯示CXCR4/CXCL12信號通路可能在炎癥部位的中性粒細胞滯留中發揮重要作用,用CXCR4抑制劑AMD3100阻斷CXCR4/CXCL12信號通路后,抑制炎癥部位的中性粒細胞浸潤,減輕急性矽肺病小鼠肺部炎癥和纖維化[19-20]。本研究結果顯示,模型組中大鼠肺組織中SDF-1和CXCR4的蛋白表達較對照組升高,CA不同量組SDF-1和CXCR4的蛋白表達較模型組降低,同時AMD3100組中大鼠的肺功能評估、白細胞數量、促炎因子水平以及SDF-1、CXCR4蛋白表達均與高劑量CA組無顯著差異。揭示了CA與AMD3100作用一致,均可以阻斷SDF-1/CXCR4信號通路,抑制肺組織中炎性細胞分泌炎癥介質,減輕炎癥反應。由此本研究推測CA減輕COPD大鼠氣道炎癥的具體機制可能與SDF-1/CXCR4信號通路被阻斷有關。

綜上所述,CA可能通過抑制SDF-1/CXCR4軸來緩解COPD大鼠的氣道炎癥。本研究為治療COPD提供了新的藥物和策略。但COPD的核心特征炎癥涉及的機制比較復雜,因此CA改善COPD肺組織損傷的具體機制還有待進一步深入研究。