外周血宏基因組二代測(cè)序在肺炎中的應(yīng)用價(jià)值

王東輝 俞小衛(wèi) 許婷 楊明夏 王曉華

在肺炎的診斷和治療過(guò)程中,及時(shí)有效的確定致病菌意義重大,然而常規(guī)微生物檢測(cè)(conventional microbiology testing ,CMT)方法發(fā)現(xiàn)病原體的比例不足40%[1]。宏基因組二代測(cè)序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)作為一種新興的檢測(cè)技術(shù),敏感度高,時(shí)效性快,越來(lái)越多的應(yīng)用于感染性疾病的診斷和治療。mNGS檢測(cè)的標(biāo)本不受限制,痰液、血液、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、腦脊液甚至組織都可以進(jìn)行病原學(xué)方面的檢測(cè)。已經(jīng)有不少研究發(fā)現(xiàn),肺炎患者中BALF mNGS在病原學(xué)檢出方面要優(yōu)于CMT[2-5],但是國(guó)內(nèi)外鮮有研究專門評(píng)估血mNGS在肺炎患者中的應(yīng)用價(jià)值。因此本文旨在初步探索外周血mNGS技術(shù)在肺炎患者中微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KY323-01),回顧性分析了2019年8月至2021年10月在常州市第二人民醫(yī)院住院并進(jìn)行mNGS檢測(cè)的肺炎患者。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥18歲。(2)社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)以及重癥肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2016年版CAP診斷和治療指南[6]。(3)同時(shí)進(jìn)行CMT和mNGS檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)mNGS檢測(cè)的標(biāo)本不是血液。(2)未使用華大醫(yī)學(xué)的mNGS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

二、研究方法

收集入選患者的一般資料,包括性別、年齡、合并癥、影像學(xué)資料和診斷。CMT方法包括:痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)、BALF培養(yǎng)、軍團(tuán)菌抗體檢測(cè)、肺炎鏈球菌抗原檢測(cè)、支原體/衣原體抗體檢測(cè)、1,3-β-D-葡聚糖試驗(yàn)(G試驗(yàn))、血清半乳甘露聚糖抗原試驗(yàn)(GM試驗(yàn))、病毒核酸檢測(cè)、病毒抗原抗體檢測(cè)等。檢測(cè)結(jié)果根據(jù)2016年版CAP診斷和治療指南進(jìn)行判讀[6]。

mNGS檢測(cè):從外周靜脈采取3～5mL血液,在6℃～35℃環(huán)境中儲(chǔ)存和運(yùn)輸。使用華大醫(yī)學(xué)的PMseq?病原微生物高通量基因檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。將檢測(cè)出的病原微生物與空白對(duì)照、華大基因環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比,刪除可疑的背景微生物。

綜合分析患者的病史、影像學(xué)資料、CMT以及mNGS檢測(cè)結(jié)果來(lái)判斷肺炎的致病菌,并以此為金標(biāo)準(zhǔn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行作圖。計(jì)數(shù)資料采用n(%)表示,計(jì)量資料采用中位數(shù)(M)和四分位間距(IQR)表示。采用McNemar檢驗(yàn)用于兩配對(duì)樣本的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般情況

回顧性的分析了2019年8月至2021年10月在常州市第二人民醫(yī)院住院并進(jìn)行mNGS檢測(cè)的患者。經(jīng)過(guò)篩選,在排除非肺炎患者以及使用其他體液標(biāo)本(痰、BALF、腦脊液等)進(jìn)行檢測(cè)的患者后,最終有28例患者納入了研究。在這28例患者中,男性13例(46.4%),女性15例(53.6%),中位年齡69(55,79)歲。重型肺炎19例(67.9%),非重型肺炎9例(32.1%)。心腦血管疾病(39.3%)是最常見(jiàn)的合并癥,后續(xù)依次是惡性腫瘤(28.6%)、肝腎疾病(21.4%)、糖尿病(17.9%)和慢性呼吸疾病(7%)(表1)。

表1 患者的臨床特征[n(%)/M(P25,P75)]

二、肺炎患者血mNGS和CMT檢測(cè)結(jié)果比較

28例患者中,mNGS的微生物陽(yáng)性率為78.6%(22/28),8例(28.6%)檢測(cè)出細(xì)菌,7例(25%)檢測(cè)出真菌,16例(57.1%)檢測(cè)出病毒,2例(7%)檢出鸚鵡熱衣原體。CMT的微生物陽(yáng)性率為64.3%(18/28),6例(21.4%)檢測(cè)出細(xì)菌,14例(50%)檢測(cè)出真菌,其中6例僅有G試驗(yàn)試驗(yàn)或GM試驗(yàn)陽(yáng)性,無(wú)法區(qū)分特定真菌。3例(10.7%)檢測(cè)出病毒。兩種方法相比較,微生物檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.338),但是mNGS在病毒檢出方面要優(yōu)于CMT(P=0.004),而在細(xì)菌(P=0.625)和真菌(P=0.118)方面無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)(圖1A)。兩種方法檢測(cè)到的具體病原學(xué)類型(見(jiàn)表2)。

圖1 A:所有納入的肺炎患者中血mNGS和CMT在病原學(xué)檢出方面的比較;B:重癥肺炎患者中血mNGS和CMT在病原學(xué)檢出方面的比較

表2 所有納入的患者中兩種方法檢測(cè)到的病原學(xué)種類[n(%)]

三、重癥肺炎患者血mNGS和CMT檢測(cè)結(jié)果比較

19例重癥肺炎患者納入了研究。mNGS的微生物陽(yáng)性率為78.9%(15/19),6例(31.6%)檢測(cè)出細(xì)菌,6例(31.6%)檢測(cè)出真菌,12例(63.2%)檢測(cè)出病毒,1例(5%)檢測(cè)出鸚鵡熱衣原體。CMT的微生物陽(yáng)性率為68.4%(13/19),4例(21.1%)檢測(cè)出細(xì)菌,11例(57.9%)檢測(cè)出真菌,其中4例僅有G試驗(yàn)或GM試驗(yàn)陽(yáng)性,無(wú)法區(qū)分特定真菌。3例(15.8%)檢測(cè)出病毒。同樣,二者病原體檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.687)。mNGS對(duì)病毒的檢出依舊優(yōu)于CMT(P=0.035),而對(duì)細(xì)菌(P=0.5)和真菌(P=0.508)的檢出仍無(wú)優(yōu)勢(shì)(圖1B)。兩種方法檢測(cè)到的具體病原學(xué)類型(見(jiàn)表3)。

表3 重癥肺炎患者中兩種方法檢測(cè)到的病原學(xué)種類[n(%)]

四、血mNGS確診的致病菌

綜合分析患者的病史、影像學(xué)資料、CMT以及mNGS檢測(cè)結(jié)果來(lái)判定致病菌。7例患者的致病菌依賴mNGS確診,其中6例重癥肺炎,1例非重癥肺炎。確診的致病菌中,耶氏肺孢子菌(pneumocystis jirovecii,PJ)2例,PJ合并巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)2例,鸚鵡熱衣原體2例,腺病毒1例(表4)。

表4 血mNGS確診的致病菌類型

討 論

盡管血液一直被認(rèn)為是無(wú)菌環(huán)境,但是國(guó)外一項(xiàng)研究表明健康人體的血液中也會(huì)有細(xì)菌存在[7]。Langelier等[8]更是使用mNGS技術(shù)發(fā)現(xiàn),重癥肺炎患者的血液中能夠檢測(cè)到呼吸道標(biāo)本中的細(xì)菌DNA。這意味著呼吸道病原體DNA釋放入血要比想象中的更普遍,而且能夠使用mNGS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。但是在肺炎患者中比較血mNGS和CMT在病原學(xué)診斷方面的研究很少,其中Farnaes等[9]在15例兒童肺炎患者中進(jìn)行了研究。這些患兒平均年齡4.16歲,其中10例合并有胸腔積液或膿胸,9例因?yàn)椴∏樾枰诒O(jiān)護(hù)室中進(jìn)行治療。86%的患兒可以通過(guò)血mNGS檢測(cè)到病原體,而CMT只有47%。但是我們的研究發(fā)現(xiàn)血mNGS和CMT的病原學(xué)陽(yáng)性率(78.6%vs64.3%,P=0.338)無(wú)顯著差別,即使在重癥肺炎亞組中,兩者仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(78.9%vs68.4%,P=0.687)。

本研究發(fā)現(xiàn),mNGS在對(duì)病毒的檢出優(yōu)于CMT,最常檢出的病毒類型為細(xì)環(huán)病毒、EB病毒、CMV。由于細(xì)環(huán)病毒和EB病毒在人群中廣泛存在[10-11],且檢測(cè)到的序列數(shù)較少,未被認(rèn)定為致病的病原體。而2例CMV和1例腺病毒有著較高的序列數(shù)(分別為291、464、1239),同時(shí)結(jié)合影像學(xué)表現(xiàn),被認(rèn)為是導(dǎo)致肺炎的病原體。病毒是肺炎一大常見(jiàn)病原體,國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)肺炎患者中病毒檢出率為15%～34.9%[6],國(guó)外的系統(tǒng)性綜述發(fā)現(xiàn)該比例為22%～24.5%[12-13]。用于病毒檢測(cè)的CMT主要是呼吸道拭子核酸和血清抗體,但是這些方法僅能針對(duì)特定的病毒,存在可檢測(cè)種類少、無(wú)法檢測(cè)未知病毒等缺點(diǎn),難以滿足臨床需求。而mNGS不僅可以檢測(cè)出常見(jiàn)病毒,在診斷新發(fā)病毒和罕見(jiàn)病毒方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),比如2019年底爆發(fā)的新型冠狀病毒。但是對(duì)于一些常見(jiàn)病毒,由于在體內(nèi)普遍存在,如果檢測(cè)出的序列數(shù)較少,則無(wú)明確的臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn),mNGS和CMT在真菌檢出方面無(wú)顯著差異,但CMT以念珠菌檢出為主,而mNGS以PJ檢出為主。國(guó)內(nèi)國(guó)外有研究使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)呼吸道標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),PJ在免疫健全人體中的定植比例為14.29%～20%[14-15],這意味著BALF中檢出的PJ未必是致病菌。對(duì)于健康人體的血中是否存在PJ尚不清楚,但在感染者的外周血中卻可以輕易檢測(cè)到。顧鵬等[16]對(duì)37例臨床診斷為肺孢子菌肺炎的患者進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn),血mNGS的敏感度為94.59%,特異度為100%。這意味著如果臨床懷疑PJP,可以采用外周血進(jìn)行mNGS檢測(cè),而不必使用BALF。同時(shí)使用mNGS技術(shù)還發(fā)現(xiàn)54.3%的患者合并有CMV感染。這與我們的研究結(jié)果相似,在4例明確為PJ感染者中,2例檢出較高序列數(shù)的CMV。PJP和CMV肺炎都常見(jiàn)于免疫抑制患者,且二者在影像學(xué)上的表現(xiàn)相似,臨床上鑒別困難,而使用mNGS技術(shù)有助于二者的診斷。我們的研究中還有2例通過(guò)血mNGS診斷為鸚鵡熱衣原體肺炎。鸚鵡熱衣原體使用CMT診斷缺點(diǎn)明顯,且大部分三甲醫(yī)院都不具備條件。通過(guò)對(duì)已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)分析后發(fā)現(xiàn),mNGS技術(shù)已經(jīng)成為鸚鵡熱衣原體肺炎主要的確診手段[17-19]。

BALF是肺炎患者最佳的檢測(cè)標(biāo)本。有研究表明,BAFL mNGS在檢測(cè)細(xì)菌和真菌方面的敏感度要高于血mNGS,不過(guò)在某些病毒方面如CMV、EB病毒,血mNGS略占優(yōu)勢(shì)[20]。但是臨床上總有一些不適宜或不愿意進(jìn)行氣管鏡檢查的患者。比如部分PJ感染的患者在入院時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的呼吸衰竭并進(jìn)行了無(wú)創(chuàng)機(jī)械通氣,無(wú)法耐受氣管鏡檢查,血液可作為退而求其次的mNGS檢測(cè)標(biāo)本。而且有研究表明,血液mNGS對(duì)PJ的檢出率不劣于BALF mNGS,但是檢出的PJ序列數(shù)要顯著低于BALF[21]。此外,對(duì)于已經(jīng)出現(xiàn)膿毒癥休克的肺炎患者,也可以考慮使用血液進(jìn)行NGS檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外均有研究表明,使用血mNGS檢測(cè)技術(shù)能夠提高膿毒癥患者中病原體的診斷率[22-26]。膿毒癥休克是診斷重癥肺炎的主要標(biāo)準(zhǔn)之一,本研究中通過(guò)血mNGS確診病原體的7例患者中,6例是重癥肺炎。盡管mNGS技術(shù)在感染性疾病的病原學(xué)診斷方面展現(xiàn)出巨大潛能,但仍需客觀看待其檢測(cè)結(jié)果。不論是CMT還是mNGS,都僅是為我們提供診斷線索,不作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。最終確診需要結(jié)合患者臨床特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)以及影像學(xué)表現(xiàn)等綜合分析。

本研究存在一些局限性:1.本文納入的病例數(shù)偏少。考慮到不同檢測(cè)公司的技術(shù)差異,我們選擇了業(yè)內(nèi)最早進(jìn)行NGS檢測(cè)的一家公司的檢測(cè)結(jié)果用以研究。另外由于我們研究所使用的標(biāo)本是外周血,但臨床上更多的肺炎患者是使用BAFL進(jìn)行mNGS檢測(cè)。兩個(gè)因素共同導(dǎo)致了研究樣本量較少。2.本研究中的患者在進(jìn)行血mNGS檢測(cè)時(shí)已經(jīng)進(jìn)行了相應(yīng)的抗感染治療,這可能會(huì)減少外周血中的病原體數(shù)量,從而降低mNGS對(duì)病原菌檢測(cè)的敏感性。3.雖然我們探討了血mNGS結(jié)果對(duì)病原學(xué)診斷的影響,但是未進(jìn)一步深入研究mNGS結(jié)果對(duì)病人住院時(shí)間、抗生素使用、機(jī)械通氣時(shí)間以及死亡率等臨床結(jié)局的影響。這些結(jié)局顯然有著更重大的臨床意義,因此未來(lái)仍需要更大的樣本量以及更充實(shí)的數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行此方面的研究。

綜上,盡管很多研究表明肺炎患者中BALF mNGS在病原學(xué)診斷方面優(yōu)于CMT,但本研究提示血mNGS與CMT相比無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)。不過(guò)當(dāng)懷疑患者存在病毒、PJ、鸚鵡熱衣原體感染,而又無(wú)法獲取BALF時(shí),可以考慮使用血mNGS進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。