716例痰涂片抗酸染色陽性患者非結核分枝桿菌菌種鑒定及其宿主風險因素分析

高雯琬 王鵬森 楊伏萍 廖傳玉 黃正谷 陳玉 李曉旭 韓梅 李同心

非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)是機會致病病原體。最近幾年,NTM感染導致的非結核分枝桿菌肺病(NTM-PD)在結核病高負擔國家和低負擔國家的患病率都急劇升高,NTM-PD正在成為一種具有全球威脅性的疾病[1-3]。由于多種因素的影響,在臨床上完全區分NTM-PD與肺結核是具有挑戰性的,這將導致不適當的抗結核治療[4]。因此,準確鑒別分枝桿菌的種類對患者的診斷和治療至關重要。此外NTM分布具有地理多樣性,在中國南方地區流行率高,北方地區流行率低[2]。雖然已有研究分析了NTM的流行情況和風險因素[5-7],但每個國家和地區由于自然環境以及人群生活習慣等不同,可能還是會產生差異。因此,本研究將探索重慶及周邊地區的716例痰涂片抗酸染色陽性患者中非結核分枝桿菌菌種鑒定情況及其宿主風險因素。

資料與方法

一、臨床資料

收集2020年1月到2020年6月在重慶市公共衛生醫療救治中心收治的716例痰涂片抗酸染色陽性患者的臨床資料,包括住址、性別、年齡、結核病史和是否具有其他病癥(HIV、COPD、肝炎、糖尿病和腫瘤)。納入標準:(1)不設年齡限制。(2)患者的痰涂片抗酸染色陽性,并均具有呼吸道不適癥狀。(3)影像學表現:肺部有陰影,和(或)鈣化、滲出、增殖、結節、空洞、淋巴結腫大等。(4)NTM的診斷參考《非結核分枝桿菌病診斷與治療指南(2020年版)》[8]和《NTM病治療指南》[9],即從同一患者的兩份痰液標本中是否分離出相同的菌種,來判斷NTM為定植菌還是致病菌。肺結核(pulmonary tuberculosis, PTB)診斷參照國家衛生和計劃生育委員會發布的現行肺結核診斷標準(WS 288—2017)。排除標準:菌種鑒定為MTB/NTM雙重感染的患者和NTM為定植菌的患者。本研究獲得醫院倫理委員會批準(2019-015-01-KY)。

二、研究方法

采用廈門致善生物科技公司生產的NTM菌株分型試劑盒(熒光PCR溶解曲線法)對716例患者連續兩次間隔24小時的晨痰標本進行菌種鑒定。按試劑說明書進行操作。采用廠家配套的提取試劑盒對患者痰液進行核酸提取,取25 μL核酸提取物或陰陽性質控對照品至預干粉PCR反應管中,蓋緊PCR八連管管蓋。瞬時離心數秒,進行PCR擴增和熔解曲線分析。PCR反應體系為25 μL,具體擴增反應程序為:UNG酶處理50 ℃,2 min;預變性95 ℃,10 min;變性95 ℃,15 s,退火57 ℃,20 s,延伸78 ℃,20 s,共55個循環;保溫40 ℃,30 min。溶解分析程序為40 ℃～95 ℃,采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道熒光信號,連續采光,升溫速率為0.04 ℃/S。

三、統計學處理

本研究采用SPSS 17.0軟件進行分析。采用非條件邏輯回歸分析與NTM感染相關的因素,相關因素包括性別,年齡,結核病史和并發癥(COPD,糖尿病,肝炎,腫瘤和HIV)。以NTM感染作為因變量(PTB=0,NTM-PD=1),建立單因素二元Logistic模型。在該模型中,將P<0.05的因素再進行多因素二元Logistic分析,計算優勢比(OR)及其95%置信區間(CI),P<0.05具有統計學意義。

結 果

一、 分枝桿菌菌種鑒定情況

716例患者中有632例患者的痰液經鑒定為MTB(88.268%),37例為NTM(5.168%),10例(1.397%)為NTM和MTB雙重感染,37例為定植菌(5.168%)。37例NTM患者中包含11例胞內分枝桿菌,12例膿腫分枝桿菌,6例鳥分枝桿菌,3例堪薩斯分枝桿菌,3例其他分枝桿菌,1例偶發/豬分枝桿菌和1例蘇加分枝桿菌。胞內分枝桿菌(1.536%,11/716)、膿腫分枝桿菌(1.676%,12/716)和鳥分枝桿菌(0.838%,6/716)是本地NTM主要流行菌種(見圖1)。

圖1 NTM菌種流行情況

二、NTM宿主風險因素的單因素分析

對所有變量進行單因素分析,結果顯示,地區(OR=7.586,95%CI:1.029～55.921)、COPD(OR=4.852,95%CI:1.966～11.971)、糖尿病(OR=0.107,95%CI:0.015～0.790)、HIV(OR=3.361,95%CI:1.095～10.316)和腫瘤(OR=5.488,95%CI:1.443～20.868)具有統計學差異(P<0.05)(見表1)。

三、NTM宿主風險因素的多因素分析

由于重慶地區病人比例較大(77.7%,559/719),所以本研究中將不對“地區”這一變量進行多因素分析。對篩選出來的變量(COPD、糖尿病、HIV和腫瘤)進行多因素分析,賦值變量表(見表2)。結果顯示,與非糖尿病患者相比,糖尿病患者(OR=0.104, 95%CI:0.014～0.793)可能感染NTM的風險較低(P<0.05);COPD(OR=5.018,95%CI:1.966～12.804)、HIV(OR=3.855, 95%CI:1.224～12.143)和腫瘤(OR=6.226, 95%CI: 1.509～25.691)是NTM感染的高風險因素(P<0.05)(見表3)。

表2 NTM感染風險因素的賦值情況

表3 非結核分枝桿菌患者基本特征的多因素Logistic回歸分析結果

討 論

近年來,NTM感染的發病率正在不斷增加。大約30%的NTM感染者錯誤地接受結核病治療,而且大多數NTM菌株對常規一線抗結核藥物具有天然耐藥性,導致治療失敗[10]。因此,NTM的流行是全球公共衛生面臨的一個新挑戰。NTM感染其臨床和影像學表現與結核分枝桿菌有相似之處,尚未有明確的診斷辦法,此外,NTM菌種的分類正在迅速更新和變化。所以,準確和及時的診斷NTM并鑒定其亞種對臨床治療和防止誤診具有重要作用[11]。

16S rRNA基因測序法是基于核酸序列的NTM菌種鑒定方法中最直接可靠的方法。有研究表明[12],本研究中所采用的熒光PCR溶解曲線法試劑與16S rRNA基因測序法的一致率能達到97%。熒光PCR溶解曲線的檢測步驟較基因芯片法和PCR反向點雜交法更簡單,人工耗時更少,不需要特殊的儀器。因此,本研究中所采用的熒光PCR溶解曲線法NTM分型試劑盒,適合配備熒光定量PCR儀器的各級實驗室使用。

由于戈登分枝桿菌一般不具有致病性或致病性弱,分離到該菌株可能為污染或短暫的定植[8]。在本研究中,37例患者的兩份痰液中僅一份分離鑒定為戈登分枝桿菌,以《非結核分枝桿菌病診斷與治療指南(2020年版)》[8],《NTM病治療指南》[9]和患者的臨床診斷為依據,故37例戈登分枝桿菌判定為非致病菌。因此,在重慶及其周邊地區,肺部NTM感染者占5.168%,胞內分枝桿菌(1.536%)、膿腫分枝桿菌(1.676%)和鳥分枝桿菌(0.838%)是主要流行菌種。在2019年有文章指出,在重慶地區NTM流行的主要菌種分別是膿腫分枝桿菌、胞內分枝桿菌和偶發/豬分枝桿菌[13]。這與本研究所得結果有所不同,可能有兩種原因造成該結果,一是由于本研究所收集的病人信息和樣本時間段為新冠疫情初始階段,這必將導致許多病人因為疫情原因不能及時到院治療。二是前者的研究中所用的方法學為PCR反向點雜交法,兩種方法的檢測原理不同,其敏感度也可能不同。

在不同地區與國家,NTM菌種的流行分布情況是不同的。在歐洲和北美,鳥分枝桿菌、蟾分枝桿菌和偶發分枝桿菌是主要流行菌種。而在南美,NTM流行的菌種主要是鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌和偶發分枝桿菌[14]。這主要是因為NTM菌種流行具有地理多樣性,例如溫度、濕度和人群生活習慣的不同。

本研究在NTM感染的相關風險因素分析中發現COPD是NTM感染的高風險因素。COPD可通過引起黏膜損傷和局部免疫損傷而導致NTM易感性增加,包括分泌物清除障礙、氣道表面液體成分異常、痰液成分異常以及持續性炎癥引起的氣道損傷[15]。Piersimoni C.[16]也指出在免疫功能正常的成人中,NTM肺病多繼發于先前有呼吸道阻塞和/或呼吸道結構破壞的慢性基礎肺病患者中。這些患者的粘液纖毛清除功能和氣道分泌物排除功能明顯受損,因此為NTM的定植和發展提供了合適的微環境,從而導致機會感染[17]。同時,NTM感染也可能導致COPD患者的疾病進展和肺功能惡化[18]。

免疫系統受損導致無法清除體內的非結核分枝桿菌,是NTM感染的關鍵因素。因此T細胞數量低下或功能缺陷的患者面臨NTM感染的風險更大。HIV感染者,特別是CD4+T細胞計數低于50/uL的患者,更容易感染NTM[19]。在本研究中,我們也證實了這一點。相較于非腫瘤患者,腫瘤患者也可能因為體內免疫系統受到破壞而導致NTM感染。而與非糖尿病患者相比,糖尿病患者的NTM感染風險可能較低,與其他研究報道一致[5]。目前對于糖尿病是否為NTM感染的低風險因素,并未有詳細的研究。

綜上所述,在本研究中NTM主要流行的菌種是胞內分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和鳥分枝桿菌。此外,COPD、HIV和腫瘤是NTM感染的高風險因素。在臨床工作中,臨床醫生應該多意識到這些相關因素與NTM的關聯,并使用所有可用的診斷工具來確認或排除NTM感染。但本研究仍然存在一定的局限性,如患者納入數量不夠多、時間不夠長等,未來我們將繼續收集NTM和MTB的相關信息,進一步完善本研究。