棉類紡織品文物霉變菌株的分離與鑒定

曾祥鶴

(開封大學(xué)藝術(shù)設(shè)計學(xué)院,河南開封 475000)

0 引 言

紡織品文物作為我國文化遺產(chǎn)的重要組成部分,是古代文明的載體之一,也是我國文化軟實力的重要代表。紡織品文物通常是由蠶絲、棉麻、葛布等天然材料織造而成,在掩埋、挖掘以及保存的過程中易受侵蝕細(xì)菌、軟腐真菌和腐生真菌等微生物的侵蝕和降解[1]。霉菌對紡織品的危害是持久的、多樣的,霉菌能夠?qū)⒑刑肌⒘虻葼I養(yǎng)源的棉、毛和絲纖維分解為養(yǎng)分,促進自身快速繁殖和生長;同時霉菌分泌有機酸和色素對文物造成酸蝕、顏色污染,甚至造成腐爛和降解等危害[2],并且霉菌具有頑強的生命力,有的能持續(xù)幾十年的休眠期。目前留存在世的紡織品文物服飾通常是從棺槨、土壤中發(fā)掘,有研究表明埋藏于地下的服飾類文物微生物降解主要來自侵蝕細(xì)菌和軟腐真菌,在紡織品文物中至今已發(fā)現(xiàn)30余屬200多種霉菌[3-4];博物館中常見的霉菌有根霉菌、曲霉菌、球毛殼菌、青霉菌等,紡織品文物相較于瓷器文物、木質(zhì)文物、金屬文物等更容易受到腐蝕[5]。陶婭妃[6]對紡織物上霉變微生物進行分離鑒定,共得到三種致霉菌,分別為曲霉屬、青霉屬和根霉屬。王毅婧[7]對真絲文物上的霉變微生物進行分離鑒定,共得到三種致霉菌孢霉屬、曲霉屬和芽枝霉屬。紡織品文物又因其材質(zhì)、染料、顏料、性質(zhì)等因素,在館藏過程中易受外界環(huán)境影響[8]。因此,對紡織品文物上的真菌進行分離鑒定,確定致霉優(yōu)勢菌屬,根據(jù)其生長規(guī)律和生理生化特性,為紡織品文物開發(fā)長效防霉技術(shù)靶標(biāo)菌株[9-10],對文物保護具有重要意義。目前對紡織品霉變菌株的研究多利用生物技術(shù)手段對霉變菌株進行分離純化、形態(tài)學(xué)鑒定以及生物學(xué)鑒定,從而確定致霉優(yōu)勢菌屬,為文物的清洗、修復(fù)、保存奠定理論基礎(chǔ)[11-12]。

本研究從已發(fā)生霉變的棉類紡織品文物上的酶菌斑塊提取霉菌,利用PDA培養(yǎng)基分離純化,得到了單一的菌株,再采用顯微形態(tài)學(xué)觀察與18S rDNA-ITS序列分析相結(jié)合的方法對霉變微生物進行鑒定[13-16],確定致霉優(yōu)勢菌屬,為紡織品文物的博物館防霉保護工作以及抗霉材料的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 樣品和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1霉變織物 本次實驗所采集的霉菌來自河南省開封市汴繡私人博物館中一件表面明顯發(fā)生霉變的棉織物文物(圖1),據(jù)記載該文物屬于晚清年間,文物常年保存在室內(nèi)溫度23～25 ℃,相對濕度65%～70%之間的環(huán)境中。通過對織造組織以及毛邊顯微鏡觀察分析可知該文物是棉織物。霉菌附著在紡織品文物表面,成散落狀,服裝對襟領(lǐng)口處霉斑較為明顯,暫無侵蝕織物內(nèi)部結(jié)構(gòu)跡象。

圖1 霉變紡織品文物Fig.1 Mildewed textile relics

1.1.2試劑 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯切塊200 g,煮沸20～30 min,過濾,濾液加入葡萄糖20 g,瓊脂15 g,蒸餾水定容至1 L。液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基成分和配制方法相同,不加瓊脂。以上培養(yǎng)基經(jīng)過高壓滅菌后使用。引物采用真菌通用引物(表1),由上海生物工程有限公司合成。Taq PCR Master Mix試劑盒購自上海生物工程有限公司;Agarose LE購自河南東格生物技術(shù)有限公司;真菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.1.3儀器 超凈工作臺:蘇州蘇潔凈化設(shè)備股份有限公司;振蕩培養(yǎng)箱:上海智誠科學(xué)儀器公司;可見分光光度計:海精密科學(xué)儀器有限公司;滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;顯微鏡:Nikon;凝膠成像系統(tǒng):東勝有限公司。

1.2 方法

1.2.1霉變菌株采集、分離、純化 用無菌棉簽輕輕擦拭汴繡文物表面霉斑部位,輕輕涂在PDA培養(yǎng)基平板中,于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5～7 d形成菌落[17]。挑選菌落,在新的PDA培養(yǎng)基平板中劃線,繼續(xù)培養(yǎng)。5～7 d后選擇菌落形態(tài)典型、分離效果明顯的平板,分別挑取單菌落邊緣的菌絲,轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基平板上繼續(xù)培養(yǎng),經(jīng)此方法3次純化后獲得單菌落菌株。

1.2.2形態(tài)學(xué)鑒定 利用無菌接種環(huán)挑取少量純化后的菌落菌絲,在PDA培養(yǎng)基平板中間點植接種。于28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5～7 d形成菌落,觀察菌落的生長情況和形態(tài)特征,并拍照,按照《真菌鑒定手冊》對分離得到的霉菌進行初步鑒定[18]。利用乳酸石炭酸染料對菌絲進行染色,觀察顯微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2.3霉菌DNA提取 取純化過的菌落或菌絲接種于PDA液體培養(yǎng)基中,于28 ℃條件下于搖床震蕩培養(yǎng)3 d。收集1～2 mL菌液,離心棄上清。根據(jù)試劑盒說明書對霉菌DNA進行提取。

1.2.4分子生物學(xué)鑒定 擴增真菌ITS序列,使用通用引物ITS1和ITS4。PCR反應(yīng)體系以及條件如表2所示。PCR產(chǎn)物進行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測,觀察條帶形狀。同時委托上海生工公司對其進行序列測定。將測序結(jié)果提交至NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析對比,使用Mega7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 PCR反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件Table 2 PCR reaction system and reaction conditions

2 結(jié)果和討論

2.1 分離純化結(jié)果

通過分離純化獲得6株霉菌。依次編號為A、B、C、D、E、F(圖2)。

圖2 霉菌菌落形態(tài)與顯微形態(tài)(100×)Fig.2 Mold colony morphology and microscopic morphology (100×)

2.2 形態(tài)觀察結(jié)果

菌株A:生長速度緩慢,28 ℃培養(yǎng)7 d菌落直徑約25～40 mm,菌落呈絨毛狀,初期呈白色,后變?yōu)榫G褐色,但邊緣呈白色,PDA培養(yǎng)基中未見菌絲,但在液體PDA培養(yǎng)基中有菌絲,且呈白色。反面觀呈淡黃色。顯微結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌絲較長,分生孢子梗在頂端分枝產(chǎn)生小梗如帚狀,偶有單論生或不規(guī)則者,孢子多數(shù)呈雙胞,呈球形或卵圓形,壁光滑,分生孢子鏈?zhǔn)杷刹灰?guī)則。

菌株B:生長速度比較緩慢,28 ℃培養(yǎng)7 d菌落直徑約25～30 mm菌落初期呈白色,后期呈綠色,邊緣為白色,未見菌絲。反面觀呈淡黃色。顯微結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌絲細(xì)長,菌絲上有較多散落的孢子,大多數(shù)為單孢且易脫落,有些孢子聚團形成孢囊,呈圓盤狀。分子孢子梗發(fā)生于基質(zhì),梗基緊湊,瓶梗呈柱狀。

菌株C:生長速度較快,28 ℃培養(yǎng)5 d菌落直徑約25～40 mm,菌落呈絨毛狀,初期呈白色,后期變?yōu)槟G色,中央凹陷,顏色較深;反面觀中央呈墨綠色,邊緣呈白色。顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),菌絲細(xì)長,上面有較多散落的孢子,菌絲不易被乳酸石炭酸棉藍色染液染色,呈淡黃色,孢梗莖呈褐色,表面光滑,分生孢子呈圓形或橢圓形,灰褐色。

菌株D:生長速度適中,28 ℃培養(yǎng)6 d菌落直徑達30～40 mm菌落呈菊花心樣結(jié)構(gòu),中央呈綠色,邊緣呈白色,帶有放射性溝紋。初期為黃色,中期變?yōu)辄S綠色,最后顏色變淡,反面觀呈淡黃色。顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),菌絲較短,分生孢子梗無橫隔,梗的定端形成球狀膨脹形成頂囊,上面附著許多分生孢子。

菌株E:生長速度較快,28 ℃培養(yǎng)5 d菌落直徑約40～50 mm,菌絲體較長、呈白色,絨狀、纖細(xì)、具隔膜,中央凸起,呈輻射狀向周圍生長。背面觀中央呈紅色,其余為白色。顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),菌絲分叉較多,孢子較小呈紡錘形,附著在菌絲上,菌核形狀多為球形,單生或叢生。

菌株F:生長速度較快,28 ℃培養(yǎng)5 d菌落直徑約60～80 mm,菌落呈絨毛狀,菌絲較長呈灰白色,中央凸菌絲較少,呈墨綠色;反面觀,呈墨綠色,邊緣呈白色。顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),菌絲細(xì)長成簇,孢子梗較短,單生或叢生,大多不分枝,分生孢子較長呈淡褐色附著在菌絲上,呈紡錘狀或倒棒狀,頂端呈喙?fàn)?成鏈生長。

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.11.0%的瓊脂糖凝膠檢測 按照試劑盒說明書,提取菌株基因組DNA按照上述條件對ITS基因片段進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ITS基因片段的PCR擴增產(chǎn)物在500 bp到750 bp之間有特異性擴增條帶,大小與預(yù)期值相符。

2.3.2測序結(jié)果 根據(jù)生工公司(上海)測序結(jié)果,將得到的基因序列與NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫中收錄的基因序列進行同源性比對,選取數(shù)據(jù)庫中得分最高的序列作為參比對象,測序比對結(jié)果見表3。菌株A和菌株B與青霉菌屬(Penicillium)霉菌同源性高達92%,但是菌株A和菌株B的18S rDNA-ITS序列有所差異,因此猜測菌株A和菌株B為同屬不同種,初步斷定為青霉菌屬;菌株C和菌株F與交鏈孢霉屬(Alternaria)霉菌同源性分別為99%和98%,但是菌株C和菌株F的18S rDNA-ITS序列有所差異,因此猜測菌株C和菌株F為同屬不同種,初步斷定為交鏈孢霉屬;而菌株D與曲霉屬(Aspergillus)霉菌同源性高達98%,初步斷定為曲霉屬;菌株E與鐮刀菌屬(Fusarium)霉菌的同源性高達100%,初步斷定為鐮刀菌屬。

表3 霉變微生物的18S rDNA-ITS序列分析Table 3 Sequence analysis of 18S rDNA-ITS in molds

在Mega7.0中構(gòu)建6種霉菌18S rDNA-ITS序列的統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)進化樹的自展值均超過50,表明構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可信。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果,菌株A和菌株B與草酸青霉在一個分支,均為青霉屬;菌株C與鏈格孢霉在一個分支,均為交鏈孢霉屬;菌株D與米曲菌在一個分支,為曲霉屬;菌株E與赤霉菌在一個分支,為鐮刀菌屬;菌株F與交鏈孢霉在一個分支,為交鏈孢霉屬。通過以上分析得出,菌株A和菌株B為青霉屬,菌株C和菌株F為交鏈孢霉屬,而菌株D為曲霉屬,菌株E為鐮刀屬,但以上6種菌株無法確定到種。

2.4 討論

針對本研究鑒定出的霉菌種類與其生存特征,對后期博物館貯藏棉類紡織品文物提出以下建議:博物館在保存紡織品文物時應(yīng)注意環(huán)境衛(wèi)生,可選用防霉建筑材料,做到空氣凈化,文物入庫與出庫均需要經(jīng)過消毒處理,庫房還可通過熏蒸的方式進行環(huán)境消毒;微生物適宜生存的溫度為25～37 ℃,相對濕度為80%～90%,因此博物館可通過控制環(huán)境溫度、濕度降低霉菌活性;博物館還可通過放置霉敵、滅霉凈、鄰位苯基苯酚鈉等防霉劑抑制霉菌的生命活動。

目前國內(nèi)多家單位均進行了博物館防霉、殺蟲等技術(shù)研究,通過抑菌實驗,測量各類試劑抑菌程度。然而各類防霉劑是否對紡織品文物直接或間接產(chǎn)生損害還需進一步的研究,單純的抑菌實驗只能判斷藥劑是否抑菌,卻不一定能應(yīng)用于實際當(dāng)中。如植物提取精油雖能有效抑菌,但會影響紡織品面料表面色澤,給文物保護帶來不可逆轉(zhuǎn)的損害。肖雨嫣[19]等對霉變棉織物上的霉菌進行了抑菌實驗,采用山梨酸鉀、硫酸鋅和苯甲酸鈉作為抑菌劑,雖證明此類試劑對霉菌的抑制作用,但無法排除此類試劑對棉類紡織品文物的傷害,因此,紡織品文物抑菌實驗的實現(xiàn)與突破,需要生物技術(shù)手段、文物復(fù)制技術(shù)等多方面努力。根據(jù)不同菌屬的生長習(xí)性和紡織品文物特性,有針對性地開發(fā)防霉劑以及選擇合適的儲存條件,對紡織類文物的保護具有重要意義。

3 結(jié) 論

本研究選取已產(chǎn)生霉變的棉類紡織品文物衣襟上的霉株,利用PDA培養(yǎng)基分離純化共得到6種不同形態(tài)的霉菌。通過對6種霉菌基因組DNA的ITS區(qū)擴增測序,同時與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中已知菌種序列對比以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,鑒定結(jié)果顯示,2種為青霉屬、2種為交鏈孢霉屬、1種為曲霉屬、1種為鐮刀屬,但無法鑒定到種。通過上述實驗發(fā)現(xiàn),該件棉類紡織品文物霉變菌屬分別為青霉菌屬、交鏈孢霉屬、曲霉屬、鐮刀屬,霉菌的產(chǎn)生原因暫時不明,人體皮脂污染、穿著污染、保存環(huán)境等均會對文物的侵蝕產(chǎn)生一定的影響。