補氣益精生血中藥對人紅系細胞組蛋白修飾酶的影響

陳玨璇, 徐方蔚, 盧焯明

地中海貧血在我國南方及多個熱帶亞熱帶國家高發,嚴重危害兒童健康[1-2]。目前的婚檢產檢手段對于家族史不詳的輕型地中海貧血未必能做出準確的篩查,如父母均為輕型地中海貧血,即有可能生出中間型或重型地中海貧血患兒。這部分患兒常常需要規律輸血及除鐵,這些均為治標手段,且存在較多不良反應,對于我國及發展中國家的患者和政府公共衛生支出也是巨大的負擔[2-3]。目前我國每年仍有相當數量的地中海貧血患兒不斷降生,而現存的很多地中海貧血患兒也尚未能得到很有效的治療,這既是當今醫學的難題,也成為重要的社會問題。

對于β珠蛋白基因缺陷的β地中海貧血而言,誘導γ珠蛋白表達以代償β珠蛋白功能是其重要的新型治療手段,但目前各種誘導西藥均有免疫抑制等明顯副作用[4-5]。我們既往發現健脾補氣生血的中藥黃芪、黨參及補腎益精生血的中藥龜板等可激活人類紅系細胞株γ珠蛋白基因的表達[6]。隨后的臨床研究顯示上述中藥組成的補氣益精生血方藥對兒童β地中海貧血有良好療效且副作用小,能有效誘導患兒γ珠蛋白基因的表達、合成胎兒血紅蛋白而發揮代償正常血紅蛋白的作用[7-9],其誘導機制與激活p38絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號通路[8-9]等有關。我們的前期體外研究還提示中藥可通過p38MAPK通路增強γ珠蛋白基因啟動子區組蛋白磷酸化乙酰化修飾,使相關區域染色質結構松散而基因易于轉錄[10]。至于中藥是否通過影響組蛋白酶從而提高修飾水平,目前尚未明了。本研究在既往基礎上繼續深入,觀察本課題中藥能否影響人紅系細胞組蛋白修飾酶相關指標,包括組蛋白脫乙酰基酶(histone deacetylase,HDAC)中的HDAC1、HDAC2,組蛋白乙酰基轉移酶(histone acetyltransferase,HAT),以期進一步從表觀遺傳角度揭示中藥治療地中海貧血的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 目前永生化的人紅系細胞K562為研究珠蛋白基因表達及胎兒血紅蛋白誘導的常用工具,本研究選用K562細胞株作為研究對象,由廣州致邦生物科技有限公司提供[賽庫生物(CellCook),貨號CC1901]。

1.1.2 藥物 黃芪、龜板、黨參1∶1∶1水提物(補氣益精生血中藥),黃芪、黨參1∶1水提物(補氣生血中藥)以及龜板水提物(益精生血中藥)分別按2.5 g/L及10 g/L的濃度委托廣州中醫藥大學中西醫結合基礎研究中心以水提法進行制備。丁酸鈉(Sigma公司)。

1.1.3 試劑 Trizol試劑(Thermo Fisher公司);胎牛血清、RPMI中性1640培養基(GIBCO公司);PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司);EpiQuikTMm6A RNA Methylation Quantification Kit試劑盒(EPIGENTEK公司);RIPA裂解液、聚丙烯酰胺凝膠(碧云天公司);二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(美侖生物公司);IgG二抗、HDAC1一抗,HDAC2一抗、HAT一抗(Abcam公司);超敏化學發光試劑盒(Millipore公司)。

1.1.4 儀器 勻漿機(IKA公司);-80 ℃冰箱(NBS公司);高速低溫離心機(科大創新公司);微量移液器(GILSON公司);全自動實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司);酶標儀(PerkinElmer公司);蛋白電泳儀(BIO-RAD公司);顯影儀成像分析系統(UVP公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 分組及加藥 K562細胞株取8等份,根據我們前期濃度梯度及時間梯度預實驗得出的高、低誘導濃度與最佳誘導時間,按以下8組分別加藥:(1)以2.5 g/L黃芪、龜板、黨參1∶1∶1水提物誘導96 h的為補氣益精低劑量組;(2)以10 g/L黃芪、龜板、黨參1∶1∶1水提物誘導96 h的為補氣益精高劑量組;(3)以2.5 g/L黃芪、黨參1∶1水提物誘導96 h的為補氣低劑量組;(4)以10 g/L黃芪、黨參1∶1水提物誘導96 h的為補氣高劑量組;(5)以2.5 g/L龜板水提物誘導96 h的為益精低劑量組;(6)以10 g/L龜板水提物誘導96 h的為益精高劑量組;(7)以500 μmol/L丁酸鈉誘導72 h的為陽性對照組(丁酸鈉組);(8)未加藥處理的為空白對照組。

1.2.2 γ珠蛋白基因表達水平檢測 誘導結束后收集各組細胞。從Genbank查得γ珠蛋白基因序列,設計引物如下:Forward:5′-GGC AAC CTG TCC TCT GCC TC-3′,Reverse:5′-GAA ATG GAT TGC CAA AAC GG-3′。以Trizol裂解K562細胞,加氯仿抽提總RNA,利用PrimeScript RT逆轉錄酶逆轉錄合成cDNA,以cDNA為模板,實時PCR擴增γ基因核酸。采用TB Green作為熒光素分子標志,實時讀取熒光強度并自動描出各樣本擴增曲線。根據Ct值、標準曲線以及以內參基因GAPDH核酸量矯正,算出每個樣本γ基因的核酸拷貝數。實驗重復3次。

1.2.3 HDAC1、HDAC2、HAT活性檢測 提取細胞總RNA。制備緩沖液、抗體溶液、增強劑溶液及陽性對照品,制備標準曲線。按照說明書添加稀釋液體、培養及進行酶反應。反應終止后在450 nm處讀取吸光度。用專門公式計算m6A在總RNA中的含量。

1.2.4 HDAC1、HDAC2、HAT基因mRNA水平檢測 HDAC1引物如下:Forward:5′-CGC TCC ATC CGT CCA GAT AAC ATG-3′,Reverse:5′-GCC ACA GAA CCA CCA GTA GAC AAC-3′。HDAC2引物如下:Forward:5′-CGA GCA TCA GAC AAG CGG ATA GC-3′,Reverse:5′-AGC CAC ATT TCT TCG ACC TCC TTC-3′。HAT引物如下:Forward:5′-GTC TGG AAT GCT GTG TGC TGG AG-3′,Reverse:5′-GCC GCC GTG AGT CTT CTT GTA C-3′。其余方法同1.2.2。

1.2.5 HDAC1、HDAC2、HAT蛋白水平檢測 裂解K562細胞,提取總蛋白,二喹啉甲酸蛋白濃度測定,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉聚偏二氟乙烯膜。封閉洗滌后,分別以HDAC1、HDAC2、HAT的一抗、二抗先后與蛋白孵育雜交,以GAPDH蛋白為內參照,使用超敏化學發光試劑盒曝光顯影,通過顯影儀分析系統分析每個樣本目的蛋白條帶與內參照條帶的積分光密度值(integrated optical density,IOD)比值。

2 結果

2.1 γ珠蛋白基因mRNA水平 經內參基因核酸量矯正的γ珠蛋白基因mRNA的相對拷貝數見表1。單因素方差分析結果顯示,各組間差異有統計學意義(P<0.001)。其中補氣益精高劑量組、補氣高劑量組、益精低劑量組及丁酸鈉組的γ珠蛋白基因mRNA水平均顯著高于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組γ珠蛋白基因mRNA水平

2.2 HDAC1、HDAC2、HAT酶活性水平 各組K562細胞經酶標儀比色法測定的HDAC1、HDAC2、HAT酶活性水平見表2。單因素方差分析結果顯示,各組差異有統計學意義(P<0.001)。各中藥組的HAT酶活性水平均高于空白對照組,其中,補氣益精高、低劑量組及益精高、低劑量組與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。丁酸鈉組HDAC1酶活性水平顯著低于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組HDAC1、HDAC2、HAT酶活性水平

2.3HDAC1、HDAC2、HAT基因mRNA水平 經內參基因核酸量矯正的γ珠蛋白基因mRNA的相對拷貝數見表3。單因素方差分析結果顯示,HAT基因組間比較差異有統計學意義(P<0.001),其中補氣益精高、低劑量組,益精高劑量組以及丁酸鈉組均顯著高于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 HDAC1、HDAC2、HAT基因mRNA水平

2.4 HDAC1、HDAC2、HAT蛋白水平 各組HDAC1、HDAC2的Western Blot蛋白條帶經內參照蛋白矯正的IOD比值比較差異無統計學意義(P>0.05)。HAT蛋白組間比較差異有統計學意義(P<0.001),其中補氣益精高劑量組和益精高劑量組顯著高于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。HAT蛋白及內參蛋白條帶見圖1。

圖1 各組Western Blot蛋白條帶圖像

3 討論

γ珠蛋白基因誘導是β地中海貧血治療手段的研究熱點之一[4-5]。即通過藥物或手段誘導γ胎兒珠蛋白基因在兒童期重新高表達,γ珠蛋白鏈與過剩的α鏈結合生成胎兒血紅蛋白(α2γ2),一方面可在功能上彌補由于β珠蛋白合成障礙所導致的正常成人血紅蛋白的減少,另一方面結合過剩的α鏈可糾正珠蛋白鏈的不平衡,減少α四聚體對紅細胞的損傷,減輕溶血及無效造血,從而改善貧血,減少并發癥。現存為數不多的誘導西藥均存在各種副作用,比如抑制免疫或抑制骨髓,或者價格昂貴、藥效短暫等,可用于臨床的還不多。近年我們把研究的目光轉到了副作用較小的傳統中醫中藥。

我們前期對兒童β地中海貧血的中醫證候規律研究顯示,兒童β地中海貧血的主要證候是脾虛氣血不足及肝腎陰精虧虛[11-12],繼而我們擬定了健脾補氣生血和補腎益精生血結合,即補氣益精生血的核心治法,并結合課題組的系列體外實驗結果[6,13-14],制定了以黃芪、黨參、龜板組成的補氣益精生血復方進行了多項臨床研究。結果表明補氣益精生血治法方藥能有效提升β地中海貧血患兒的總血紅蛋白及胎兒血紅蛋白水平,改善紅細胞、平均血紅蛋白含量等血液學指標及中醫證候,也未發現有抑制骨髓抑制或影響肝腎功能等副作用[7-9,15-16]。其起效機制與誘導γ珠蛋白基因表達合成胎兒血紅蛋白、激活p38MAPK信號通路以及調節相關紅系轉錄因子等有關[8-9,16]。至于其下游對珠蛋白基因的表觀遺傳調控,課題組研究顯示單味龜板以及黃芪多糖均可通過p38MAPK信號通路提高γ珠蛋白基因啟動子區組蛋白修飾水平[10],而啟動子區組蛋白修飾水平高則基因更容易表達,達到誘導γ珠蛋白基因表達的目的。但中藥是否通過影響組蛋白修飾的相關催化酶從而增強組蛋白修飾,目前還未明確。

本實驗結果顯示,無論是中藥還是陽性對照藥丁酸鈉,各用藥組的γ珠蛋白基因mRNA水平均高于空白對照組,再次驗證了本課題中藥可誘導γ珠蛋白基因的表達。其中補氣益精高劑量組和益精低劑量組誘導效果明顯優于丁酸鈉,而有部分中藥組與空白對照組差異無統計學意義,可能與樣本量較小及組內變異較大有關。

組蛋白的乙酰化磷酸化等活性修飾可令染色質結構松散,產生開放功能域,有利于基因轉錄。HDAC1、HDAC2可抑制組蛋白的乙酰化,而HAT則會增強組蛋白的乙酰化。人類在新生兒期后HDAC逐漸使γ珠蛋白基因啟動子區域的組蛋白去乙酰化,染色質結構致密,故γ珠蛋白基因不再表達,而使用丁酸鈉等HDAC抑制劑則可恢復組蛋白乙酰化,從而促進γ珠蛋白基因的表達[17-18]。我們原本猜想中藥可能與丁酸鈉有類似抑制HDAC的效果,但實際實驗結果顯示中藥卻是提升了HAT的酶活性。我們進一步觀察了人紅系細胞內各乙酰化修飾酶基因的mRNA水平及蛋白水平,發現多組中藥對HAT的mRNA轉錄表達均有顯著性上調作用。而最終翻譯后的蛋白水平,只有補氣益精高劑量組及益精高劑量組可顯著提升HAT蛋白表達。尤其是補氣益精高劑量組,在HAT的酶活性、mRNA水平及蛋白水平三項指標上均有一致顯著性的提升。這提示我們補氣益精生血的中藥可能通過上調HAT的表達進而促進紅系細胞內γ珠蛋白基因啟動子區組蛋白的乙酰化修飾,從而誘導γ珠蛋白基因的進一步表達。

p38MAPK通路是外源信號從細胞表面傳導到核內染色質的重要傳遞者,它介導胞內蛋白激酶的級聯反應,影響核內基因轉錄,活化的p38MAPK可發生轉位進入核內,將修飾信號逐級傳遞至γ珠蛋白基因啟動子區域的組蛋白或相關轉錄因子,促進紅系分化及誘導基因表達[19-20]。目前除我們課題組外,中藥對人紅系細胞p38MAPK-組蛋白修飾路徑影響的研究鮮見報道,下一步實驗可設立以p38MAPK特異抑制預處理的對照組,再觀察中藥對組蛋白修飾酶的影響,驗證HAT水平的提升及乙酰化的增強確實依賴于上游的p38MAPK的活化。我們的系列研究從表觀遺傳角度揭示中醫藥治療β地中海貧血的分子機制,為開發地中海貧血的國家中藥新藥提供實驗依據,課題對于我國地中海貧血高發區具有較大的實用價值、廣泛的應用前景及重要的社會意義,對研究人類發育階段特異性的珠蛋白表達轉換及人類表觀遺傳調控也將提供一定科學參考價值。