從微生態角度探討分娩方式與抗生素對新生兒高膽紅素血癥發生和治療的影響

唐煒, 金方強, 唐婷, 孫勤

新生兒高膽紅素血癥的發生率呈逐年上升趨勢,是新生兒入院治療的常見病之一。過高的血清膽紅素可以通過血腦屏障干擾神經細胞的正常代謝,尤其是早期新生兒,其血腦屏障通透性較高,中樞神經系統對毒性物質十分敏感,在血清未結合膽紅素水平較高的情況下極易造成神經系統功能紊亂產生膽紅素腦病和膽紅素腦損傷,是臨床上新生兒致死殘疾重要原因之一[1-2]。另一方面,人體腸道為菌群提供了良好的生長和棲息環境[3]。研究表明,超過350種菌群寄生在人體腸道內,包括致病性和共生性微生物,它們相互作用和影響以保持動態平衡,在營養、維持生命中起著重要的作用[4-7]。在胃腸道中,菌群與宿主間相互制約、相互依存,處于動態平衡狀態[8-9],但是微生態系統失衡可導致細菌異位、免疫功能紊亂,使機體發生多種疾病[10-11]。新生兒腸道微生態始于母親子宮內,但嬰兒期是腸道菌群形成的關鍵時期,具有動態變化、對外敏感、易受刺激等特點[12]。包括早產、配方奶喂養、抗生素治療、分娩方式等都對腸道微生態多樣性和機體免疫功能的狀況有直接的影響[13-14]。其中,抗生素使用可造成腸道微生物群改變致使菌群定植異常,影響腸黏膜屏障保護功能[15-17]。本研究擬通過16s rRNA高通量測序方法[18]為基礎,比較不同分娩方式和不同抗生素使用情況下高膽紅素血癥新生兒腸道菌群分布特點,不同分娩方式高膽紅素血癥新生兒腸道菌群代謝產物變化,腸道微生態與新生兒高膽紅素血癥的發生發展存在相關性。基于此研究,通過早期分娩方式的宣傳教育和治療中抗生素應用的規范化,旨在為預防和更好地治療新生兒高膽紅素血癥提供基礎理論數據支撐和臨床應用實踐。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取江蘇大學附屬醫院2021年1～12月新生兒科入院治療的新生兒高膽紅素血癥患者90例作為研究對象,其中男47例,女43例;胎齡(38.8±1.3)周;出生體質量(3.35±0.41)kg。

按患兒出生方式又分為剖宮產組57例和順產組33例。兩組新生兒在性別、胎齡、出生體質量方面比較差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性,見表1。

表1 剖宮產組和順產組患兒一般資料比較

患兒入新生兒科有部分高膽紅素血癥新生兒預防性使用了抗生素3 d,根據抗生素使用情況分為頭孢地嗪組32例,頭孢西丁組30例和空白對照組(未使用抗生素)28例。3組患兒在性別、胎齡、出生體質量方面比較差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性,見表2。

表2 頭孢地嗪組、頭孢西丁組和對照組患兒一般資料比較

同期選擇我院產科母嬰同室新生兒40例作為正常對照組。高膽紅素血癥組和正常對照組新生兒在性別、胎齡和出生體質量方面比較差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。見表3。

表3 高膽紅素血癥和正常對照組新生兒一般資料比較

1.2 診斷標準 參照《新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識》中新生兒高膽紅素血癥的診斷標準[19]。

1.3 納入標準 (1)新生兒母親為初產婦,年齡20～30歲,無妊娠高血壓、腎臟疾病、貧血及糖尿病等妊娠期合并癥。(2)胎兒出生時無產傷窒息,Apgar評分正常,出生體質量2 500～4 000 g,胎齡37～42周,生后半小時開奶。(3)產后3～5 d皮膚出現黃染,血清總膽紅素超過Bhutani曲線95百分位數,以非結合膽紅素增高為主。(4)患兒家屬知情同意,且本研究已通過江蘇大學附屬醫院生物醫學研究倫理委員會審查(SWYXLL20200429-4)。

1.4 排除標準 出生時或生后伴有呼吸窘迫、頭顱血腫、顱內出血、新生兒出血病、咽下綜合征等。

1.5 研究方法

1.5.1 標本采集、保存和處理 采集高膽紅素血癥組新生兒入院第1天治療前、治療后第3天及產科正常對照組新生兒糞便標本,-80 ℃低溫保存備用。

1.5.2 腸道菌群檢測 (1)以16s rRNA高通量測序為檢測依據。提取納入研究的新生兒糞便標本gDNA,通過Onedrop檢測gDNA濃度和純度,瓊脂糖凝膠檢測其質量;檢測合格后進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠檢測PCR產物的濃度和質量,MD酶標儀檢測產物濃度,QiagenQIAquick PCR purification kit回收產物,Aglient 2200 Bioanalyzer進行質控;合格后予IlluminaMiseq高通量測序儀進行測序。

(2)生物信息學分析:對原始數據進行拼濾后得到有效數據,基于有效數據進行operational taxonomic units(OTUs)聚類和物種分類分析,并將OTU和物種注釋結合,從而得到每個樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結果。再對OTUs進行豐度分析,菌群屬水平相對豐度計算公式=該菌的基因拷貝數/總拷貝數。

1.6 高未結合膽紅素血癥腸道細菌代謝產物的檢測 操作人員戴無菌手套和口罩,用無菌離心管采集高膽紅素血癥和正常對照組新生兒納入研究治療前的糞便標本,每一例收集約10 g糞便,-80 ℃保存備用。采用液相色譜質譜聯用技術檢測糞便上清液中細菌代謝產物變化,比較高膽紅素血癥和正常新生兒腸道菌群代謝產物變化,分析與高膽紅素血癥相關的代謝標志物。

液相色譜為美國Thermo公司超高效液相色譜系統,色譜柱為(BEH)C18柱,流動相A為超純水,流動相B為色譜純乙腈,流動相中加入0.1%(V/V)甲酸,流速0.3 mL/min;以線性梯度洗脫,初始條件為2%的流動相B保持0.5 min,2%～50%流動相B(0.5～9 min);50%～98%流動相B(9～12 min),98%流動相B(12～13 min),98%～2%流動相B(13～14 min),平衡色譜柱1 min后采集下一個樣品。每次進樣量為4 μL,柱溫40 ℃,自動進樣器溫度維持在4 ℃。電噴霧電離源正負離子電離模式。離子源溫度120 ℃,脫溶劑溫度300 ℃,脫溶劑氮氣流速650 L/h,錐孔反吹氮氣50 L/h。正離子和負離子模式毛細管電離電壓分別為3.0 kV和2.8 kV,錐孔電壓為27 eV,碰撞能為6 eV,四極桿掃描范圍50～1 500 m/z。

運用非參數單變量檢驗方法——秩和檢驗篩選高膽紅素血癥和正常新生兒之間顯著差異性代謝物;使用錯誤發生率檢測法對結果進行檢測,以降低上一步中篩選出的差異性代謝物假陽性率;運用主成分分析法和最小二乘判別分析法對差異性代謝物進一步篩選,結合人類代謝物數據庫和京都基因和基因組百科全書數據庫查找上述篩選出的代謝物來源及涉及的代謝通路,同時分析是否存在來源于人類腸道菌群參與的代謝通路。

2 結果

2.1 新生兒腸道菌群主成分分析 高膽紅素血癥組新生兒腸道菌群屬水平相對豐度前96%的菌屬,比較正常新生兒和高膽紅素血癥新生兒腸道菌屬之間的差異,結果顯示,共檢出46種差異有統計學意義的細菌,其中腸球菌屬、埃希菌屬、未分類的腸桿菌科等細菌在高膽紅素血癥新生兒腸道內含量明顯高于正常新生兒,差異有統計學意義(P<0.05);擬桿菌屬、未分類的毛螺菌科、普雷沃菌屬等細菌在正常新生兒腸道內含量明顯高于高膽紅素血癥新生兒,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 高膽紅素新生兒和正常新生兒腸道菌群分析[M(P25,P75)]

基于所有菌屬,完成高膽紅素血癥新生兒腸道菌群主成分分析。結果顯示,剖宮產出生和順產出生高膽紅素血癥新生兒腸道菌群比較差異有統計學意義(P<0.05),且剖宮產出生的新生兒更容易發生高膽紅素血癥,差異有統計學意義(P<0.05)。入院治療后,頭孢地嗪組、頭孢西丁組和空白對照組高膽紅素血癥新生兒腸道菌群比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同分娩方式和不同抗生素干預高膽紅素血癥

2.2 不同分娩方式高膽紅素血癥新生兒腸道菌群分析 剖宮產組和順產組高膽紅素血癥新生兒腸道菌群屬水平相對豐度前96%的菌屬,比較兩組新生兒腸道菌屬之間的差異,結果顯示,高膽紅素血癥新生兒中順產組與肉食桿菌屬、紫單胞菌科呈正相關(P<0.05),剖宮產組與未分類的腸桿菌科呈正相關(P<0.05)。見圖1和表5。

表5 剖宮產組和順產組高膽紅素血癥新生兒組腸道差異菌群相關性分析

2.3 不同抗生素使用組高膽紅素血癥新生兒腸道菌群分析 頭孢地嗪組、頭孢西丁組和空白對照組高膽紅素血癥新生兒腸道菌群屬水平相對豐度前96%的菌屬存在明顯差異。結果顯示,高膽紅素血癥新生兒中頭孢地嗪組、頭孢西丁組與雙歧桿菌呈負相關(P<0.05),空白對照組與肉食桿菌屬、腸球菌和乳桿菌屬呈負相關(P<0.05),空白對照組與浮絲藻屬和韋永球菌屬呈正相關(P<0.05),頭孢地嗪組與未分類的腸桿菌科和韋永球菌屬呈負相關(P<0.05)。見圖1和表6。

表6 頭孢地嗪組、頭孢西丁組和空白對照組高膽紅素血癥新生兒組腸道差異菌群相關性分析

2.4 抗生素使用高膽紅素血癥新生兒腸道代謝產物特征 與正常對照組新生兒相比,抗生素使用組高未結合膽紅素血癥新生兒代謝變化主要在磷酸戊糖途徑(P<0.01),主要代謝通路是丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝(P<0.01)。腸球菌和肉食桿菌屬與差異代謝產物琥珀酸呈正相關(rs=0.692 3,0.521 7,P<0.01)。

3 討論

本研究顯示,剖宮產和順產出生高膽紅素血癥新生兒腸道菌群存在明顯差異,肉食桿菌屬、紫單胞菌科與順產組高膽紅素血癥新生兒存在正相關性,未分類的腸桿菌科與剖宮產組高膽紅素血癥新生兒存在正相關性。剖宮產出生的新生兒更容易發生高膽紅素血癥,差異具有統計學意義。順產分娩的新生兒腸道菌群的多樣性明顯多于剖宮產分娩的新生兒。研究表明,嬰兒出生前腸道呈無菌狀態,出生第1周內,其腸道菌群的首次演替受母體腸道微生態、分娩方式、喂養類型[20-21],因此在新生兒腸道定植的微生物來源于母體的產道和腸道[22]。相比較,順產分娩的新生兒腸道有益微生物總占比更高,腸道菌群具有更高的多樣性,但剖宮產的新生兒要相對單一。進一步研究發現,剖宮產新生兒腸道差異菌群未分類的腸桿菌科屬于醫院環境中常見的微生物,幾乎從臨床各科感染標本中都能分離培養出腸桿菌科的細菌。其中,革蘭陰性桿菌感染近年來呈現增長趨勢,約占醫院感染的60%～65%。同時,腸桿菌科在院內感染中除自身感染或醫療過程中導管、插管、輸液、手術等交叉感染外,與醫院環境中醫護人員手、物體表面等可能也有一定關系,具有潛在的致病性,抗生素耐藥性的可能性也更高。因而我們可以預判,超過80%的剖宮產嬰兒都會攜帶那些在醫院中廣泛存在的機會性致病菌,且伴隨時間變化,嬰幼兒腸道內菌群種類由需氧菌和兼性厭氧菌向厭氧菌轉變,腸道菌群從無到有、從簡單到復雜、從不穩定到穩定發生進一步轉變。另一方面,本研究通過入院治療中使用頭孢地嗪組,頭孢西丁組和對照組相比較,高膽紅素血癥新生兒腸道菌群存在明顯差異,雙歧桿菌與頭孢地嗪組和頭孢西丁組高膽紅素血癥新生兒存在負相關性,肉食桿菌屬、腸球菌和乳桿菌屬與對照組高膽紅素血癥新生兒存在負相關性,浮絲藻屬和韋永球菌屬與對照組高膽紅素血癥新生兒存在正相關性,未分類的腸桿菌科與頭孢地嗪組高膽紅素血癥新生兒存在負相關性。根據前期研究,約47%的新生兒接受過一種及以上抗生素,其使用合理性仍然存疑[23-24]。例如,抗生素的早期使用與炎癥性腸病有相關性[25-26],新生兒即使只接受一次阿莫西林療程也會擾亂腸道微生物群的組成[27]。本研究表明,抗生素使用會使大便菌群多樣性降低,增加腸道潛在致病的腸球菌、肉食桿菌等的百分比,同時降低益生菌雙歧桿菌的比例[28-29],新生兒期抗生素暴露與腸道微生態存在密切聯系[30]。同時,腸道微生物在膽紅素的腸肝循環和膽紅素的排泄中起著重要的作用。在剖宮產出生和抗生素使用的新生兒腸道微生物群中,益生菌明顯減少,有害細菌明顯增加。這些有害細菌可能通過半乳糖代謝途徑參與膽紅素代謝,導致微生物群失衡[31]。在膽紅素代謝中,新生兒正常腸道菌群可以轉化偶聯膽紅素轉化為糞膽紅素原,其中大部分隨糞便排出。當新生腸道菌群發生失衡,膽紅素腸肝循環加速,導致新生兒高膽紅素血癥。微生物多樣性減少是生態失調的主要特征。腸道物種多樣性的降低會影響膽紅素代謝。代謝組學分析發現,與空白對照組新生兒相比,抗生素使用組高膽紅素血癥新生兒代謝變化主要在磷酸戊糖途徑,丙氨酸,天門冬氨酸和谷氨酸代謝。腸球菌和肉食桿菌屬與差異代謝產物琥珀酸呈正相關。新生兒血清膽紅素水平的升高可出現患兒全身多器官的功能損害,腸道菌群在膽紅素的代謝過程中起到了至關重要的作用,腸道菌群代謝需要的碳水化合物主要來自食物和機體蛋白質、肽和消化酶,機體葡萄糖、氨基酸和脂肪的代謝會影響腸道菌群的代謝;同時,腸道細菌同時又能參與機體代謝,完成數種宿主細胞不能催化進行的酶反應,腸道菌群及其代謝產物影響宿主的代謝穩態,機體代謝功能的障礙與腸道菌群的變化密切相關。腸道菌群還可通過改變肝功能調節膽紅素的代謝,完善免疫系統,提高肝酶活性,促進膽紅素的結合和排泄。

綜上,本研究顯示了高膽紅素血癥和正常新生兒腸道菌群存在差異,順產組和剖宮產組高膽紅素血癥新生兒以及頭孢地嗪組、頭孢西丁組和空白對照組高膽紅素血癥新生兒腸道菌群存在差異,且不同抗生素使用后高膽紅素血癥新生兒腸道菌群代謝產物變化。腸道微生物及其代謝產物對于維持血清膽紅素水平有很大的作用,加強腸道代謝有助于降低新生兒血清膽紅素水平。抗生素使用組高膽紅素血癥腸道內的差異菌群參與或影響機體葡萄糖、氨基酸等重要物質的代謝,而機體本身的各種相關代謝又可以影響腸道菌群的變化,這些代謝過程的變化可能直接或間接影響膽紅素代謝。本研究顯示了高膽紅素血癥和正常新生兒差異腸道菌群、分娩方式和抗生素的使用對高膽紅素血癥新生兒腸道菌群及其代謝產物產生的影響,這些研究結果是證明人體腸道菌群可以影響血清膽紅素水平的有力證據,探討了腸道微生態與新生兒高膽紅素血癥的發生發展存在相關性,對于預測新生兒高膽紅素血癥的發生具有指導意義,通過早期分娩方式的宣教和治療中抗生素應用的規范化,以及標志性腸道菌群在新生兒以及高膽紅素血癥新生兒預防和治療中的使用,為新生兒高膽紅素血癥的早期發現、早期預防和早期治療提供了有力的數據支撐。