加減地黃飲子對衰老小鼠睪丸組織SIRT3基因表達的影響*

黑龍江省中醫藥科學院

高 山 張佩青 楊 光△ 李長見△(哈爾濱 150036)

提要 目的：觀察加減地黃飲子對衰老小鼠睪丸組織沉默信息轉錄調節基因3(SIRT3)表達的影響。方法：選取2月齡雄性ICR小鼠作為青年組，20月齡小鼠作為老年組、維生素E組和加減地黃飲子組。青年組、老年組以生理鹽水灌胃，維生素E組、加減地黃飲子組以對應藥物灌胃。干預60 d后計算睪丸器官指數，觀測睪丸組織病理學變化，檢測各組小鼠血清睪酮和肝腎功能，檢測睪丸組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平，以RT-PCR和Western-blot法檢測SIRT3基因的mRNA和蛋白表達。結果：與老年組比較，加減地黃飲子組小鼠睪丸器官指數無差異(P>0.05)；睪丸組織結構清晰穩定，精原細胞、精母細胞、支持細胞增多；血清睪酮水平升高，肝腎功指標正常，SOD、GSH-Px水平升高，MDA水平降低，SIRT3基因mRNA及其蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論：加減地黃飲子可能影響SIRT3基因表達，減少小鼠睪丸氧化應激損傷而延緩睪丸衰老。

衰老是所有生物都會出現的自然現象，從細胞到組織，從器官到系統，隨時間出現結構和功能衰退[1]。在各個系統衰老中，生殖系統的變化對人體影響較大。老年男性性腺睪丸的功能不斷下降，引起肌肉、骨骼、精神、心理、性功能等一系列變化[2]。延緩睪丸衰老可以提高男性肌體狀態，改善生理功能，意義深遠。

中醫中藥在補腎抗衰老方面優勢獨到，加減地黃飲子源于金代名方地黃飲子。地黃飲子是補腎的經典方，在前期研究中發現此方具有良好的延緩衰老作用[3]。課題組根據當代人體質和發病譜的變化，依據臨床反饋，進行了配方的加減[4]。臨床應用中去掉附子、肉桂等過熱藥物，強化抗衰老作用，加入薄荷、桂枝、酸棗仁等，化裁形成加減地黃飲子。在男性早衰、男性功能下降等疾病治療中體現出良好療效。沉默信息轉錄調節基因3(SIRT3)基因發現與人類長壽關系密切[5]，對肌體內環境氧化、自噬、凋亡和能量代謝起重要調節作用[6-9]，具有減少氧化應激誘發的功能性和器質性損傷的作用。前期研究發現調控SIRT家族可以干預泌尿系統衰老。在此基礎上本實驗觀察加減地黃飲子對小鼠睪丸的抗衰老作用，試圖從抗衰老基因SIRT3分析內在作用機理。

1 材料

1.1 動物 雄性ICR小鼠60只，訂購于哈爾濱醫科大學動物實驗中心，生產許可證號為scxk黑2012-001。2月齡15只，體質量25～30 g；20月齡45只，體質量40～45 g。在20℃～25℃、自然照明、自由飲水進食條件下飼養[4]。此次實驗經黑龍江中醫藥大學科研倫理委員會批準開展，動物實驗編號DW20221005。

1.2 藥物與試劑 血清睪酮試劑盒：武漢華美公司；逆轉錄試劑盒(批號2001360)：上海秋博公司；β-action鼠單克隆抗體(批號063257)：廣州博歐特公司；SIRT3單克隆抗體(批號080731)：日本Anathia公司。維生素E(批號53188 0701)：西安海斯夫公司；加減地黃飲子水煎液：黑龍江省中醫藥科學院制備，藥劑濃度260 mg/mL[4]。

1.3 儀器 BK-280全自動生化分析儀：山東博科公司；超聲碎裂儀：上海靜信公司；多功能酶標儀：山東恒美公司；DNA電泳儀：Bj Liuyi Biotechnology。

2 方法

2.1 分組及干預 按月齡劃分小鼠年齡組，2月齡為青年期，20月齡為老年期。設定2月齡小鼠為青年組，20月齡小鼠隨機分為老年組、維生素E組、加減地黃飲子組。每組動物均為15只，以灌胃形式給藥。青年組、老年組灌注生理鹽水，每日10 mL/kg。維生素E組和加減地黃飲子組分別按0.25 g/kg、2.6 g/kg灌注對應藥物[4]。各組均給藥60 d。

2.2 標本采集與處理 標本采集前以乙醚吸入方式麻醉小鼠，起效后稱重。先用眼球取血法收集血液標本，離心后取上清液備用。取小鼠腹部手術切口，進入腹腔后充分顯露兩側睪丸并取出，生理鹽水沖洗后稱重備用。

2.3 睪丸器官指數測算 稱量睪丸重量和小鼠體質量。睪丸指數計算公式為睪丸重量(g)/體質量(mg)×100%。

2.4 睪丸組織病理學觀測 石蠟包埋小鼠睪丸標本，制作病理切片。以HE染色法觀察睪丸結構及精原細胞、精母細胞、支持細胞的數量形態。

2.5 睪酮、肝功能、腎功能檢測 ELISA法檢測血清睪酮水平。全自動生化分析儀檢測血清尿素氮、肌酐、丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶水平。

2.6 睪丸組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測 睪丸標本經過充分裂解，離心得到上層清液。以硫代巴比妥酸法檢測MDA活性，以酶學方法檢測SOD、GSH-Px活性[4]。

2.7 測定SIRT3基因mRNA表達 分離純化提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，RT-PCR法檢測。反應條件：90℃下預變性1 min，90℃下變性15 min，60℃下退火1 min，70℃下延伸20 s，30個循環[4]。反應體系：總反應容積25 μL，cDNA2 μL，上下游引物均為2.5 μL。PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.8 測定SIRT3基因蛋白表達 Western blot法定量測定睪丸組織蛋白表達。配制工作液，提取標本蛋白。電泳，轉膜，封閉，先后經過一抗、二抗，曝光[4]。圖像以Med8.0數碼系統分析。

3 結果

3.1 各組睪丸器官指數比較 青年組睪丸器官指數最高，其余3組顯著下降(P<0.05)。比較老年組，維生素E組和加減地黃飲子組器官指數差異無統計學意義(P>0.05)。比較維生素E組，加減地黃飲子組器官指數差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組睪丸器官指數比較

3.2 各組睪丸病理學比較 HE染色后，在10×20倍光鏡下閱片觀察。青年組小鼠睪丸結構飽滿，精原細胞、精母細胞、精子細胞及精子數量豐富，排列整齊有序，組織間隙支持細胞含量較多。老年組睪丸結構變形，精原細胞、精母細胞、精子細胞及精子數量減少，排列雜亂，組織間隙支持細胞含量減少。與老年組比較，維生素E組和加減地黃飲子組睪丸組織結構清晰穩定，精原細胞、精母細胞、支持細胞增多。與維生素E組比較，加減地黃飲子組精原細胞、精母細胞、支持細胞數量更為豐富。見圖1。

注：A.青年組；B.老年組；C.維生素E組；D.加減地黃飲子組圖1 各組睪丸組織病理學比較

3.3 各組睪酮、肝功能、腎功能水平比較 青年組睪酮水平最高，老年組下降(P<0.05)；比較老年組，維生素E組睪酮差異無統計學意義(P>0.05)，加減地黃飲子組升高(P<0.05)；比較維生素E組，加減地黃飲子組睪酮升高(P<0.05)。詳見表3。青年組肝腎功能指標數值最低，其余3組指標升高(P<0.05)，但均在正常值范圍內；3組間差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表4。

表3 各組睪酮水平比較

表4 各組BUN、Scr、ALT、AST水平比較

3.4 各組睪丸組織MDA、SOD、GSH-Px水平比較 青年組MDA水平最低，SOD、GSH-Px水平最高。老年組MDA上升，SOD、GSH-Px下降(P<0.05)。比較老年組，維生素E組SOD上升(P<0.05)，GSH-Px和MDA差異無統計學意義(P>0.05)；加減地黃飲子組MDA降低，SOD、GSH-Px上升(P<0.05)。比較維生素E組，加減地黃飲子組MDA下降，SOD、GSH-Px上升(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組SOD、GSH-Px、MDA水平比較

3.5 各組睪丸組織SIRT3基因mRNA及蛋白表達水平比較 青年組SIRT3基因mRNA及蛋白表達水平最高。老年組小鼠睪丸組織SIRT3基因mRNA及蛋白表達降低(P<0.05)。比較老年組，維生素E組SIRT3基因mRNA及蛋白表達，差異無統計學意義(P>0.05)；加減地黃飲子組mRNA及蛋白表達升高(P<0.05)。比較維生素E組，加減地黃飲子組SIRT3基因表達升高，mRNA及蛋白表達一致(P<0.05)。詳見表6、圖2。

注：A.青年組；B.老年組；C.維生素E組；D.加減地黃飲子組圖2 各組睪丸組織SIRT3基因蛋白表達水平比較

表6 各組SIRT3基因mRNA表達水平比較

4 討論

睪丸是男性生殖系統的重要器官，既是生殖功能的核心，也是雄性內分泌功能的關鍵。男性從出生到成熟，從強壯到衰老，從生精到雄激素分泌，睪丸的生理作用伴隨終生。人體進入老齡后，所有系統都在衰老，生殖系統也不例外。但生殖系統衰老對男性具有特殊意義。一方面人體失去繁衍生殖的能力，另一方面睪酮缺乏出現疲倦、乏力、焦慮、抑郁和性功能下降一系列身心紊亂的表現。而后者給生活帶來的影響更大，對衰老的恐懼，對性功能和強壯肌體的喪失，讓男性產生巨大心理壓力。因此如何干預睪丸衰老，什么時間、什么方式干預衰老，及時有效的干預睪丸衰老具有現實研究意義[10]。

目前研究表明中藥具有延緩衰老的確切作用，尤其是補腎的方劑千百年來層出不窮，通過補腎填精來延年益壽已成為歷代醫家的共識。腎藏精，主生殖。《黃帝內經》記載腎精貫穿男性生殖始終。男子“二八，腎氣盛，天癸至，精氣溢瀉”，腎精充盈出現遺精射精，為生殖初始。“五八，腎氣衰，發墮齒槁”，腎精不足而開始肌體衰老。“七八，天癸竭，精少……形體皆極”，腎精虛損而生殖枯竭。如何補腎精？不同醫家認識不一、方藥各異，常見湯方以溫補腎陽治則居多。對于生殖衰老的男性，需認識到滋補腎陰和腎陽同樣重要，不宜厚此薄彼。腎陰是生殖的物質基礎，腎陰虛損發生于內，緩慢而隱匿。腎陽是生殖的功能體現，腎陽虛形之于外，明顯易于識別。腎陰與腎陽兩者互根互用，相互交感，水火既濟。兩者的虛損多同時發生，若只溫補腎陽，則孤陰不生、獨陽不長，導致太過溫燥而腎精不充。所以填精宜腎陰腎陽雙補，兼顧陰陽平衡的補腎方劑，以達“陰平陽秘、精神乃至”。

地黃飲子首載于《宣明論方》，選取滋腎陰、補腎陽的藥物，如熟地黃、山茱萸、巴戟天、肉蓯蓉、石斛、遠志等。可以補益下元虛衰，是治療腎虛喑痱的主方。熟地黃是方中君藥，具有延緩人體衰老的作用。其特有的活性成分熟地黃多糖具有體外抗氧化性[11]。巴戟天補腎強筋骨，可以提高皮質醇水平，從而保護生殖系統、促進生精和改善腎虛證等作用[12-14]，用于治療腎虛陽痿不育、宮寒不孕、遺精滑精等證[12-15]。肉蓯蓉補五勞七傷，肉蓯蓉多糖可以提高細胞核內P-CREB水平，增加環腺苷酸及cAMP依賴蛋白激酶活性[16-18]。地黃飲子具有提高大鼠SOD、CAT、GSH，降低MDA的作用，清除自由基而對抗氧化損傷[19]。

維生素E具有公認的抗氧化應激作用，因此是抗衰老實驗最常選擇的對照藥物。維生素E作為抗氧化劑，長久以來應用于男科生殖疾病。對于精子活力不足的弱精子癥，維生素E一直是專家共識的推薦藥物。本實驗中維生素E組睪丸的病理結構明顯改善，SOD活性升高表明維生素E作為對照藥物的正確性和有效性。但在睪酮改善方面未看到顯著作用。

病理學顯示老年組睪丸組織整體出現萎縮、結構雜亂，精原細胞和精母細胞排列松散、數量減少，精子細胞、精子較青年組明顯減少。表明老年組小鼠生精功能進入衰退期。加減地黃飲子組睪丸組織結構相對清晰穩定，精原細胞、精母細胞和支持細胞數量遠多于老年組。表明睪丸結構的衰老得到了延緩，生精功能的細胞基礎得到了保護。

睪酮是雄激素最主要的成分，在男性血液中按晝夜節律不停地分泌。對維持性欲、性征、性功能，促進精子成熟，對中樞系統、骨骼系統和免疫功能都有著重要的作用。某種程度上男人是雄激素的“作品”。本研究中與青年組比較，老年組睪酮明顯降低，這與睪丸病理學改變相一致。而加減地黃飲子組無明顯降低，表明本方對小鼠雄激素分泌產生了干預作用。對于延緩睪丸衰老，睪酮是干預的靶點，也是療效評定的指標。由于衰老因素，用藥干預60 d后老年鼠肝腎功指標高于青年鼠，但老年組、維生素E組、加減地黃飲子組間無差異；且均在正常值范圍內，證明藥物及療程的動物安全性。

關于解釋生物衰老原因，以及如何干預衰老，氧化應激理論是經典的衰老研究路徑。課題組前期實驗發現加減地黃飲子對海馬組織、腎臟組織都有對抗氧化應激損傷，提高SOD等生物酶活性而延緩衰老的作用[4，20-21]。SOD等酶是抗衰老研究常用的指標，具有代表意義。因此本實驗試圖探索加減地黃飲子對睪丸組織是否具有同樣的抗衰老作用。實驗結果顯示實驗組睪丸組織SOD、GSH高于對照組，MDA低于對照組，表明氧化應激損傷減少。SOD、GSH活性升高增加了對氧自由基的清除，MDA活性降低可以減少細胞的結構和功能破壞而引發的老化。在對活性酶的雙重調節下，加減地黃引子起到了減少氧化應激損傷的作用，保留了睪丸性激素分泌功能，延緩了小鼠睪酮下降。

SIRT是Sirtuin基因家族成員，從T1到T7分布在不同的細胞器上。課題組前期研究發現與加減地黃飲子藥效成分相關的梓醇通過調控SIRT1基因的表達，干預大鼠腎臟衰老[21]。SIRT3與人類長壽有一定相關性[22]，增強氧自由基清除酶的活性，減少氧自由基的蓄積，可以調節氧化應激誘發的功能性損傷和器質性損傷。因此SIRT3與抗衰老關系密切，在動物模型中敲除該基因的小鼠迅速衰老[23]。能否影響該基因的表達來延緩睪丸衰老，這是我們重點關注的，因此選擇SIRT3作為重要的觀測指標。結果顯示與睪酮、抗氧化酶升高相一致，實驗組小鼠SIRT3基因mRNA和蛋白表達升高。根據結果分析，可能在加減地黃飲子影響下，SIRT3基因表達升高，睪丸組織SOD、GSH活性上升，減少了局部氧化應激損傷，改善了睪丸組織結構和功能，從而影響了小鼠雄激素分泌，延緩睪丸衰老。綜上分析加減地黃飲子具有一定的延緩小鼠睪丸衰老作用，對SIRT3基因的影響可能是其內在機制。