從海馬區膠質細胞CD137L途徑探討電針治療神經痛的作用機制

鄭昌岳，蘭艷艷，黃秋玲，江孟鴻，王志福*

1 福建省級機關醫院，福建 福州 350003；

2 福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州 350003；

3 福建中醫藥大學針灸學院，福建 福州 350122

神經病理性疼痛（簡稱神經痛）是軀體感覺系統的損害或疾病導致的疼痛，臨床表現為痛覺過敏、痛覺超敏等癥狀，并常伴隨記憶障礙［1-3］。海馬作為大腦內側顳葉的一部分，在傷害性刺激的感受以及疼痛信號的處理過程中發揮重要作用［4］。神經痛發生時，海馬功能呈現出不同尋常的表現，如記憶缺陷、膠質細胞激活和細胞因子釋放等［5-7］。CA1區作為海馬重要的功能分區之一，在痛覺調制和突觸可塑性過程中同樣扮演著重要角色［8］，疼痛信息可誘導CA1 區蛋白表達和細胞功能的改變，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）釋放等［9-11］。

大量研究證實，電針環跳、陽陵泉穴可顯著抑制神經痛，在海馬CA1 區觀察發現，電針可以減少神經痛大鼠疼痛相關神經元電生理活動的異常［12］。前期研究通過蛋白組學篩查發現，電針可抑制海馬關鍵蛋白TMEM126A 的表達，減輕神經痛敏反應，改善相關學習記憶障礙，而CD137L 是TMEM126A的重要結合蛋白［13-15］。通過文獻進一步梳理分析，CD137屬于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體家族的成員，由腫瘤壞死因子受體超家族成員9（tumor necrosis factor receptor superfamily member 9，TNFRSF9）基因編碼。CD137 是在活化的CD4+和CD8+T 細胞、NK 細胞、DC、巨噬細胞、肥大細胞等細胞上表達的誘導型共刺激受體，其配體為CD137L，表達于巨噬細胞、B細胞等。

在神經痛研究中發現，敲除CD137L 基因的小鼠疼痛閾值升高，并且早期使用CD137L 抗體能夠有效改善痛敏反應；脊髓節段CD137L 可能通過調節小膠質細胞的活化和細胞因子的釋放，促進神經痛的發生和發展［16］。然而，目前關于CD137 及配體CD137L中樞神經表達及電針鎮痛的作用機制不清。基于此，擬探討海馬CD137 及CD137L 在電針改善神經痛及學習記憶中的作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

24 只SPF 級雄性SD 大鼠，體質量160～180 g，購自浙江省醫學科學院［許可證號：SCXK（浙）2019-0002］，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心［許可證號：SYXK（閩）2019-0007］。飼養環境保持適宜的溫度、濕度、12 h光照明暗交替。本實驗操作過程嚴格按照我國相關實驗動物的規定及福建中醫藥大學動物管理制度，符合實驗動物倫理要求（審批號：FJTCMIACUC2021006）。

1.2 儀器設備和試劑

1.2.1 主要儀器設備 Von-Frey 測痛儀（美國IITC公司，型號：NC12775）；電子針療儀（型號：SDZ-Ⅱ）、一次性針灸針（規格：1寸，0.30 mm×25 mm）均購自于蘇州醫療用品廠有限公司；LEICA 冰凍切片機（德國徠卡公司，型號：CM1950）；LEICA 顯微鏡（德國徠卡公司，型號：DFC425 C）。

1.2.2 主要試劑 5-0 非吸收性外科縫線（上海浦東金環醫療用品股份有限公司）；CD137/CD137L抗體、小膠質細胞標記物（Ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba-1）抗體、星形膠質細胞標記物（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）抗體（美國Thermo 試劑公司）；GFAP、Iba-1、CD137L、TNF-α 等ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

24 只SPF 級雄性SD 大鼠適應性喂養1 周后，按照隨機數字表法分為假手術組、模型組和電針組，每組8只。

2.2 動物模型制備

參考DECOSTERD 的造模方法建立坐骨神經分支選擇性損傷（spared nerve injury，SNI）模型［17］。大鼠經異氟烷麻醉后，剃除皮毛，75%乙醇消毒，切開右后肢皮膚，鈍性分離肌肉，充分暴露坐骨神經主干及其遠端分支，鈍性分離脛神經、腓總神經和腓腸神經，5-0 絲線結扎腓總神經和脛神經并剪斷，保留腓腸神經，造模后逐層縫合，切口處覆蓋青霉素粉末預防感染。假手術組只暴露坐骨神經，不結扎不剪斷坐骨神經及分支。

2.3 干預方法

造模后第7 天開始，電針組參照《實驗針灸學》及前期研究方法［18］確定大鼠右側環跳、陽陵泉穴位置，采用常規一次性針灸針（1寸，0.30 mm×25 mm）分別刺入10 mm、5 mm，連接電子針療儀，電針頻率為2 Hz，強度為1 mA，連續波，每天干預1 次，每次30 min，連續電針21 d。假手術組和模型組大鼠同等條件下進行抓取、固定，但不給予電針干預。

2.4 行為學檢測

2.4.1 機械痛閾值檢測 參考前期研究方法［18］進行機械痛閾值測試以及數值計算。在造模前及造模后第7 天（干預前）、造模后第28 天（干預后）檢測3 組機械痛閾值。每次刺激后待大鼠重新安靜后再開始下一次刺激，測量3 次得出的平均值記錄為測試結果，代入up-and-down方法的公式計算，最終所得數值即為大鼠縮足閾值（paw withdrawal threshold，PWT），以此反映大鼠的機械痛行為學。

2.4.2 新物體識別實驗 根據嚙齒類動物具備對新的物體有探索的偏好本能，在造模后第28 天進行新物體識別實驗，以反映大鼠的學習記憶能力。① 適應階段：將動物依次放入測試箱內適應環境。每只大鼠放置在測試箱內10 min 任其自由探索，然后取出放回原籠內休息10 min，再放入測試箱10 min，最后歸回原籠位。注意每次更換動物測試前必須清除測試箱內殘留的糞便和尿液等，并用75%乙醇噴灑、擦拭、通風以消除氣味。② 訓練階段：準備2個完全相同的圓柱體（物體A 和物體B），1 個長方體（物體C）。3 個物體和大鼠的體積匹配并具備一定體質量，以避免在實驗過程中因大鼠攀爬而傾倒。先將物體A 和物體B放置在測試箱的左下角和右下角，調試視頻分析系統并定義物體和環境的區域范圍，打開錄像設備。將大鼠背對2個物體放入測試箱中。實驗人員離開測試房間以避免干擾。大鼠在測試箱內自由探索10 min 后，取出放回原籠內，間隔10 min后進行下一階段。③ 測試階段：將左下角的物體A 取出，換為物體C。打開錄像設備，同樣放置大鼠進入測試箱。實驗人員離開房間，通過錄像觀察大鼠探索情況，物體識別測試時間為10 min。測試完成后將大鼠歸回原籠內。通過視頻分析系統采集錄像，分析記錄大鼠相關指標。

2.5 樣本采集

造模后第28天進行樣本采集。用1%濃度異氟烷麻醉大鼠后，新鮮快速取腦，分離海馬CA1 區，置入EP 管液氮凍存待取。灌注取材快速灌入低溫生理鹽水，緩慢灌入低溫4%多聚甲醛，取大腦制作冰凍切片。

2.6 酶聯免疫吸附法

① 標準品稀釋：根據說明書，對標準品進行梯度稀釋，混勻備用。② 加樣：分別設空白孔、標準品孔、待測樣本孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μL，待測樣本孔中先加樣品稀釋液25 μL，再加待測樣本25 μL，輕輕晃動混勻。③ 溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。④ 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用。⑤ 洗滌：小心揭去封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去，如此反復5 次，拍干。⑥ 加酶：加入酶標試劑50 μL。⑦ 溫育、洗滌：操作同前。⑧ 顯色：每孔加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。用450 nm 波長分別測量每個孔的吸光值（A值）。整個測定的過程應在加入終止液后的15 min 內完成。通過Excel繪制標準曲線可以計算出樣品濃度值，并進行統計學分析。

2.7 免疫熒光組織化學

實驗結束后取材腰段脊髓包埋，在恒冷凍切片機內進行切片，厚度為16 μm，將切好的組織片貼附在載玻片上；將切片PBS洗5 min×3次，用基因筆畫圈，滴加封閉液，置于37 ℃恒溫箱1 h；甩掉封閉液，分別滴加一抗（小鼠抗Iba-1、小鼠抗GFAP、小鼠抗神經元標記物（Neuronal Nuclei，NeuN）、兔抗CD137、兔抗CD137L），濕盒4 ℃過夜；次日，PBS洗5 min×3次，再避光加入二抗，置于37 ℃箱1 h；PBS 洗10 min×3 次，擦去組織周圍的水分后，滴加含DAPI 的封片劑，蓋上載玻片。使用熒光顯微鏡拍攝每只大鼠海馬CA1區，每只至少隨機選取5個視野拍片，并統計分析。

2.8 統計學方法

所有數據經SPSS 25.0 統計分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較采用方差分析。不符合正態分布以中位數和四分位數間距［M（P25，P75）］表示，多組間比較采用非參數秩和檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 3組機械痛閾值、新物體識別能力比較

3 組機械痛閾值采用重復測量方差分析進行統計，數據滿足球形檢驗（P＜0.001），3 組主體內時間效應差異具有統計學意義（F＝32.54，P＜0.001），3組主體間的組別效應差異具有統計學意義（F＝31.92，P＜0.001），隨后進行兩兩比較。造模后第7 天，與假手術組比較，模型組和電針組機械痛閾值均顯著下降（P＜0.01）。電針干預21 d 后，與模型組相比，電針組可顯著提高大鼠機械痛閾值（P＜0.01）。見表1。3 組新物體識別指數采用單因素方差分析進行統計，造模后第28天，與假手術組比較，模型組新物體識別指數顯著降低（P＜0.01），提示大鼠學習記憶能力顯著下降；與模型組比較，電針組新物體識別指數顯著升高（P＜0.01），提示大鼠學習記憶能力顯著改善。見圖1。

圖1 3組大鼠新物體識別指數比較（±s）Figure 1 Comparison of new object recognition in dex in three groups (±s)

表1 3組大鼠機械痛閾值變化（±s）Table 1 Changes of mechanical pain threshold of rats in three groups （±s）

表1 3組大鼠機械痛閾值變化（±s）Table 1 Changes of mechanical pain threshold of rats in three groups （±s）

注：與假手術組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。Note: Compared with the sham group, 1) P＜0.01; compared with the model group, 2) P＜0.01.

組別假手術組模型組電針組n888造模后第28天8.78±2.45 2.10±0.431）9.80±2.632）造模前10.13±1.77 9.51±1.32 9.32±1.48造模后第7天9.50±1.87 3.34±1.401）3.77±1.191）

3.2 3 組大鼠海馬CA1 區CD137、CD137L 與神經細胞共表達情況

免疫熒光檢測表明，海馬CA1 區CD137 免疫反應陽性物質與Iba-1、GFAP 免疫反應陽性物質共標記，而與NeuN 免疫反應陽性物質未共標記。見圖2。同樣，在海馬CA1 區，CD137L 免疫反應陽性物質與Iba-1、GFAP 共標記，而與NeuN 未共標記。見圖3。

圖2 3組海馬CA1區CD137和Iba-1、GFAP、NeuN免疫熒光共標情況（×400）Figure 2 Co-labeling of CD137 with Iba-1, GFAP and NeuN immunofluorescence in hippocampal CA1 region of three groups (×400)

圖3 3組海馬CA1區CD137L和Iba-1、GFAP、NeuN免疫熒光共標情況（×400）Figure 3 Co-labeling of CD137L with Iba-1,GFAP and NeuN immunofluorescence in hippocampal CA1 region of three groups (×400)

3.3 3組海馬CA1區CD137L濃度的比較

造模后第28 天，采用ELISA 檢測大鼠海馬CA1區CD137L 濃度。與假手術組比較，模型組CD137L濃度顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，電針組CD137L濃度顯著下降（P＜0.01），見圖4。

圖4 3組大鼠海馬CA1區CD137L濃度比較Figure 4 Comparison of CD137L concentration in hippocampal CA1 region in three groups

3.4 3組海馬CA1區Iba-1、GFAP蛋白表達的比較

造模后第28 天，采用免疫熒光和ELISA 測定3 組海馬CA1 區小膠質細胞和星形膠質細胞激活標記物的表達。與假手術組比較，模型組Iba-1 免疫反應陽性細胞個數和濃度均明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，電針組Iba-1 細胞個數和濃度均明顯減少（P＜0.01）。見圖5和圖6。與假手術組比較，模型組GFAP免疫反應陽性細胞個數和濃度均明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，電針組GFAP細胞個數和濃度均明顯減少（P＜0.01）。見圖7和圖8。

圖5 3組大鼠海馬CA1區小膠質細胞標記物Iba-1表達情況（×200）Figure 5 Expression of microglia marker Iba-1 in hippocampal CA1 and the number of immunoreactive cells in three groups (×200)

圖6 3組大鼠海馬CA1區Iba-1含量變化比較Figure 6 Comparison of Iba-1 content in hippocampal CA1 region of three groups

圖7 3組大鼠海馬CA1區星形膠質細胞標記物GFAP表達情況（×200）Figure 7 Expression of astrocyte marker GFAP in hippocampal CA1 region of three groups (×200)

圖8 3組大鼠海馬CA1區GFAP含量變化比較Figure 8 Comparison of GFAP content of hippocampal CA1 region in three groups

3.5 3組大鼠海馬CA1區TNF-α釋放濃度比較

造模后第28 天，采用ELISA 檢測大鼠海馬CA1區TNF-α濃度。與假手術組比較，模型組TNF-α濃度顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，電針組TNF-α濃度顯著下降（P＜0.05）。見圖9。

圖9 3組大鼠海馬CA1區TNF-α濃度比較Figure 9 Comparison of TNF-α concentration in hippocampal CA1 region of three groups

4 討 論

近年研究表明，海馬作為疼痛矩陣腦區的組成之一，是疼痛等傷害性信息加工及修飾的關鍵腦區，在整合疼痛信息、認知記憶等方面發揮著重要的作用［19］。神經痛發生時，海馬區長時程增強（longterm potentiation，LTP）減弱，小膠質細胞活化及TNFα 釋放增多，導致疼痛發生和記憶障礙；抑制海馬區膠質細胞活化，降低TNF-α釋放，可緩解神經痛［20-22］。

坐骨神經痛歸屬中醫“痛痹證”范疇，應用足少陽經穴環跳、陽陵泉等進行電針，善治諸痛痹不仁，臨床康復效果顯著。我們前期實驗研究同樣表明，電針環跳、陽陵泉可顯著抑制坐骨神經痛，但關于海馬中樞的調控機制仍有待深入明晰［23-25］。

課題組前期蛋白組學篩選發現，電針可顯著提高神經痛海馬區TMEM126A 表達。進一步文獻梳理發現，TMEM126A 可能結合CD137L 結合，在神經痛及電針干預中扮演重要角色［14］。基于此，本研究將CD137L 及其受體CD137 作為電針干預神經痛的可能作用靶點［26］。實驗研究表明，海馬CA1 區CD137L 及其受體主要表達于膠質細胞，電針可顯著抑制神經痛海馬區CD137L 表達和膠質細胞活化，降低炎癥因子TNF-α的釋放。

CD137 又稱4-1BB，是一種有效的T 細胞共刺激分子，在活化T 細胞、NK 細胞和血管內皮細胞上表達。其配體CD137L 是一種跨膜蛋白，在活化的抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）上與CD137結合，并將激活信號傳遞到APC中［27］。CD137-CD137L 的主要功能是調節細胞存活，抑制二者結合可阻止腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptors，TNFRs）下游信號通路的激活，降低免疫炎癥反應［28-29］。

然而，CD137 和CD137L 在疼痛疾病中的探索尚屬于起步階段。WAKLEY 等［16］研究發現，基因敲除CD137L 的神經痛小鼠表現出顯著的痛敏反應，早期鞘內注射CD137L 抗體提高機械痛閾值，抑制脊髓小膠質細胞炎癥反應。體內外實驗發現，小膠質細胞與CD137L 共表達，激活小膠質細胞，誘導炎癥因子如TNF-α 等的釋放［30］。在炎癥狀態下，CD137L是巨噬細胞持續產生TNF-α 所必需的關鍵蛋白；巨噬細胞表達CD137L，與Toll 樣受體相互作用，維持TNF-α產生［31］。

綜上所述，電針可能是通過海馬CA1區CD137L調節途徑，抑制膠質細胞的激活和TNF-α 的釋放，改善神經痛大鼠疼痛及其學習記憶障礙，今后將通過CD137L 及受體病毒干擾、基因敲除等技術，進一步深入驗證CD137L/CD137在電針抗炎鎮痛中的中樞作用機制。