妊娠合并HBV感染患者TRFIA與qPCR檢測結(jié)果相關(guān)性研究

成君俐 黃麗芳 陳建斌 鄧常春 吳麗娜

（韶關(guān)市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東 韶關(guān) 512000）

乙型肝炎感染（HBV）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的病毒。孕婦一旦感染了乙型肝炎病毒，就會發(fā)生垂直傳播，對胎兒造成很大的危害，因此，及時、準(zhǔn)確地檢測出HBV病毒，對其進行有效的控制和治療是十分重要的[1-2]。目前臨床上常用的檢測方法有熒光qPCR法、TRFIA法等。其中，qPCR方法是檢測乙型肝炎病毒的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。TRFIA法主要用于初步評估機體是否存在感染，但是不能準(zhǔn)確判斷病毒傳染性的強弱；qPCR方法靈敏度較高，但檢測時易受其他因素影響[4-5]。目前關(guān)于qPCR與TRFIA兩種方法檢測結(jié)果的關(guān)聯(lián)性研究較少，本研究擬對妊娠合并HBV患者進行兩種方法檢測結(jié)果的關(guān)聯(lián)性進行評估，其將有助于對乙型肝炎患者病情進行有效性的診斷與針對性治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象是2022年1月至2022年12月我院產(chǎn)科住院部及產(chǎn)科門診收治的妊娠合并乙型肝炎患者100例，并收集保存患者血清樣本。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞20歲；妊娠1～38周；沒有使用過治療乙型肝炎藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嚴(yán)重疾病。

患者樣本的研究經(jīng)申請單位倫理審查會批準(zhǔn)，并告知所有患者研究內(nèi)容，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 方法 所有患者入組后均空腹抽取靜脈血5 mL，室溫凝固后離心，吸取上層血清，置于-85 ℃冰箱，直到檢測。

1.2.1 乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV-DNA）定量檢測 患者的血清樣品中的HBV-DNA的濃度都采用了圣湘生物科技有限公司生產(chǎn)的HBV核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法），該試劑盒包含了核酸提取試劑和擴增反應(yīng)試劑。操作方法簡述如下。

試劑準(zhǔn)備：以待測樣本、陰性對照、陽性對照以及定量參照物A～D數(shù)量為依據(jù)，按照比例（HBVPCR反應(yīng)液38 μL/人份+HBV酶混合液2 μL/人份+內(nèi)標(biāo)0.2 μL/人份）取對應(yīng)量的反應(yīng)液、酶混合液及內(nèi)標(biāo)于離心管中，將它們充分混勻成PCR-mix，瞬間離心后備用。將以上制備好的試劑移至樣品處理區(qū)，等待使用。

樣本核酸抽提（在樣本處理區(qū)進行）：從抽屜中取出0.2 mL反應(yīng)管（八聯(lián)管）、反應(yīng)管架、離心管架、吸頭以及手套。從試劑盒中取出核酸釋放劑、定量參考品和陰、陽性對照。待上述試劑成分溶解后，使用微型離心機將核酸釋放劑、定量參考品、陰性對照、陽性對照，瞬時離心，備用。取出n個0.2 mL反應(yīng)管，使用10 μL移液器向每個反應(yīng)管中先加入核酸釋放劑5 μL（建議深吸淺打，避免出現(xiàn)氣泡），然后分別加待測樣本、陰性對照、陽性對照以及定量參考品A～D各5 μL，用移液器吸打3～5次混勻。放置10 min，然后用100 μL移液器，向每管中靠壁加入PCR-mix 40 μL，無須混勻，蓋上管蓋。使用微型離心機，瞬時離心后取出（可用手指輕彈，去除氣泡），置于反應(yīng)管架上，轉(zhuǎn)移到擴增檢測區(qū)。

PCR擴增：將PCR反應(yīng)管放入ABI7500實時熒光定量PCR儀樣品槽，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性對照、陽性對照、定量參考品及待檢未知樣本。熒光檢測通道選擇：①選擇FAM通道檢測HBV-DNA。②選擇VIC通道檢測HBV。③參比熒光設(shè)置ROX。循環(huán)參數(shù)設(shè)定：50 ℃ 2 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，45個循環(huán)。

結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后自動保存，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Star值、End值以及Threshold（Star值可以在3～15，End值可設(shè)置在5～20，調(diào)整陰性對照的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊Analyze進行分析，使各項參數(shù)符合質(zhì)量控制中要求。試劑盒有效檢測下限為100 IU/mL。

1.2.2 乙型肝炎病毒標(biāo)志物（HBV-M）定量檢測 時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）檢測：乙型肝炎兩對半標(biāo)志物使用TRFIA方法進行。檢測對血清標(biāo)本中的乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物進行測定。使用Perkin ELmer Easy cuta 1260全自動時間分辨熒光分析系統(tǒng)及其配套試劑對患者血清樣本進行檢測。檢測結(jié)果陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)是：①HBsAg＞0.05 ng/mL。②HBs＞10 IU/mL。③HBeAg＞0.1 NCU/mL。④抗-HBe＞0.2 NCU/mL。⑤抗-HBc＞0.9 NCU/mL。

按照實驗室SOP的要求進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 根據(jù)TRFIA檢測結(jié)果，將乙型肝炎兩對半五項指標(biāo)陽性一致的歸為一類，如檢出HBsAg、HBeAg、HBcAb均陽性（大三陽）的樣本歸為一類，有n份，在這n份樣本中qPCR檢測結(jié)果為陽性的為m份，將這兩項結(jié)果進行比對。采用PEMS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料用[n（%）]表示，用χ2檢驗，計量資料（）進行，用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在100份血清中使用TRFIA法檢出HBsAg、HBeAg、HBcAb均陽性（大三陽）29份[29.00%（29/100）]，其中使用qPCR法檢測HBV-DNA的含量陽性27份[93.10%（27/29）]；HBsAg、HBeAb、HBcAb均陽性36例[36.00%（36/100）]，其中使用qPCR法檢測HBV-DNA的含量陽性30份[83.33%（30/36）]。TRFIA法檢測HBV-M陽性者（Ⅰ組）71份，使用qPCR法檢測HBV-DNA的含量陽性63份[88.73%（63/71）]；TRFIA法檢測HBV-M陰性者（Ⅱ組）29份，使用qPCR法檢測HBV-DNA的含量陽性4份[13.79%（4/29）]，其中Ⅰ組HBV-DNA陽性率與Ⅱ組進行比較，Ⅰ組HBV-DNA陽性率高于Ⅱ組（P＜0.05）。見表1。

表1 TRFIA法與qPCR法檢驗結(jié)果對比

3 討論

HBV感染是由病毒復(fù)制進化、宿主免疫應(yīng)答及環(huán)境因子共同作用所致的，妊娠可引起多種生理變化，產(chǎn)生多臟器效應(yīng)和免疫耐受[6-7]。在妊娠期間，母體的免疫系統(tǒng)對外來抗原進行了適應(yīng)性的耐受，這種情況伴隨著明顯的激素改變，使腎上腺皮質(zhì)激素、黃體酮和雌性激素升高[8-9]。急性乙型肝炎病毒感染轉(zhuǎn)變?yōu)槁砸倚透窝撞《靖腥镜娘L(fēng)險分別是95%左右發(fā)生在圍生期，20%～30%發(fā)生在1～5歲兒童，而成人低于5%，說明慢性HBV感染的孕婦將病毒傳播給胎兒的可能性較大[10]。所以，針對妊娠婦女的HBV感染狀況，在懷孕前或者懷孕早期，及時對HBV進行篩查，能夠有效應(yīng)對可能發(fā)生病毒傳播給胎兒事件。

TRFIA是一種利用稀土元素對抗原、抗體進行標(biāo)記的非同位素免疫分析方法，利用稀土絡(luò)合物的發(fā)光特性，采用時間分辨的方法對熒光進行測量，通過波長與時間的同步測量，可以有效消除非特異性熒光的干擾，提高分析的特異性[11]。TRFIA檢測方法是能夠?qū)颊咴跈z測期間的免疫情況有一個更好的了解，同時還能為HBV感染提供一個間接的證據(jù)，用他來排查機體是否感染了HBV，并充分了解到藥物的效果，為醫(yī)師選擇藥物提供依據(jù)。但TRFIA檢測方法并不能準(zhǔn)確判斷患者體內(nèi)HBV傳染性的強弱。而qPCR作為HBV感染的最直接證據(jù)，具有較高的敏感性和準(zhǔn)確性，是HBV感染的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。qPCR可以明確病毒的數(shù)量，可以準(zhǔn)確的判斷HBV在體內(nèi)的復(fù)制情況和傳染性的強弱，可以作為乙型肝炎兩對半檢查的有力補充。并且該方法的整個操作過程均在完全閉管的狀態(tài)下進行，不需要開蓋電泳，這樣不僅避免了核酸對環(huán)境的污染，也避免了使用致癌物溴化乙啶對人體造成的危害。

本研究結(jié)果表明，HBV-DNA與HBeAg呈正相關(guān)，病毒復(fù)制活躍、傳染性強；HBsAb陽性是一種保護性抗體，提示患者感染過乙型肝炎病毒，病程進入恢復(fù)期，無傳染性。

綜上所述，乙型肝炎病毒標(biāo)志物的含量會受到人體免疫功能、變異等多種因素的影響，如果僅僅依靠血清乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測結(jié)果，來對病情做出診斷和判斷是不充分的，而且在檢測HBV-DNA的時候，很容易受到某些人為或非人為因素的影響，而qPCR與TRFIA方法互相補充，能夠使HBV的檢測變得更加準(zhǔn)確，能夠更有針對性地采取相應(yīng)的治療措施。因此，在進行臨床工作時，可以采用兩種方法結(jié)合檢測，對妊娠患者的HBV病毒含量進行綜合分析，從而對患者的病情、檢測感染狀況及病毒的活動程度都具有較高的臨床意義。