釀酒酵母響應辛酸脅迫的研究進展

于志海，石明芝，董文軒，張美星，袁葉鑫，黃名正，劉曉柱，許存賓，唐維媛

（貴州理工學院 食品藥品制造工程學院，貴州 貴陽 550003）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是應用于乙醇生產行業的一類主要微生物，酒精發酵過程中釀酒酵母受到各種環境因子的脅迫，如乙醇[1-2]、高滲透壓[3]、呋喃醛[4]、酚類化合物[5]、硫化物[6]和高酸[7]等。其中，在酒精發酵過程中因弱有機酸而帶來的弱酸（低pH）脅迫是的常見脅迫之一[8]。近年來，釀酒酵母的弱酸脅迫響應機制研究逐漸獲得了科研工作者的關注，目前，關注的弱有機酸主要有甲酸[9-10]、乙酸[11]、檸檬酸[12]、綠原酸[13]、乳酸[14]、油酸[15]。實際上，酒精發酵過程中釀酒酵母應對的環境遠比已報道的情況復雜，因此，如何優化發酵環境、提高酵母的生產力、厘清釀酒酵母對弱有機酸脅迫的響應機制是目前面臨的重大科學問題。辛酸作為一種弱有機酸，高濃度的辛酸對釀酒酵母具有毒性，脅迫酵母細胞的生長[16-17]。釀酒酵母肯定有一套響應辛酸脅迫的應答機制，但目前學術界對該機制的解析欠深入，未獲得統一認識。基于此，從酒精發酵的視角，系統梳理了近40年來有關辛酸對釀酒酵母生長影響的文獻，就辛酸對釀酒酵母的影響、酒精發酵過程中辛酸的來源和釀酒酵母應對辛酸脅迫的部分應答機制進行了綜述，以期為全面解析釀酒酵母對辛酸脅迫的應答機制以及開發辛酸高耐受菌株提供參考。

1 辛酸對釀酒酵母的影響

辛酸[CH3（CH2）6COOH]是一種脂溶性中鏈飽和脂肪酸，可以有效治療與真菌滋生有關的疾病，如陰道酵母菌感染、念珠菌感染[18]和鵝口瘡[19]等，說明辛酸對真菌具有明顯的抑制效應。酒精發酵過程中，辛酸是公認的發酵抑制劑，在果汁發酵過程中隨著乙醇濃度的升高和pH值的降低，對釀酒酵母的毒性也逐漸增強[16]，這可能與辛酸在水中的微溶解性有關。隨著發酵的進行，乙醇的產量逐漸增多，辛酸在發酵液中的溶解度逐漸升高，提高了辛酸對酵母的毒性。有研究表明，辛酸能提高乙醇對酵母的致死效果，并且致死率與辛酸的濃度呈指數關系[20]，高濃度的辛酸對釀酒酵母的生長產生脅迫，導致發酵停滯[21]。

2 酒精發酵過程中辛酸的來源

為了探明酒精發酵過程中釀酒酵母響應辛酸脅迫的機制，首先需明確該過程中辛酸的來源，有研究表明，酒精發酵過程中的辛酸主要來源于原材料和釀酒酵母的代謝。

2.1 來源于原材料的辛酸

谷物類、水果類等糖質原料均可作為酒精發酵的原材料。過去已從肉豆蔻（Myristica fragrans）、檸檬草（Cymbopogoncitratus）、蘋果（Malusdomestica）、椰子（Cocosnucifera）、棕櫚（Trachycarpus fortunei）、啤酒花（Humulus lupulus）等多種原材料中檢測出了辛酸，其中棕櫚仁油和椰子油是天然辛酸的主要來源[22]。近年來，HUANG M Z等[23]利用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法測定了貴州省5個產地成熟刺梨的揮發性風味成分時，發現盤州地區的辛酸含量最高（約1.3 mg/L），貴定地區的辛酸含量最低（約0.04 mg/L），大方、龍里和水城地區的辛酸含量均約為0.1 mg/L。杜薇等[24]在測定5種野生蘋果（花紅、新疆野蘋果、西府海棠、海棠花和楸子）的揮發性風味成分時，發現辛酸含量為95.99（新疆野蘋果）～346.59 μg/kg（楸子）。付勛等[25]從玫瑰香橙（Citrus sinensis）果汁中檢測出的辛酸含量約占總揮發性物質的4.04%。張琦婧[26]研究發現，諾麗（Morinda citrifolia）果汁中含有大量辛酸，并且是其“腐臭干酪”類氣味的主要來源。

酒精發酵結束后，辛酸與醇類物質形成相應的酯類物質，辛酸乙酯和辛酸異戊酯是酒類產品中常見的辛酸酯類物質，已在濃香型白酒[27]、枳椇高粱混釀酒[28]、葛根蒸餾酒[29]、小曲清香型白酒[30]、凱里糯米酒[31]、黑糯米酒[32]等酒類產品中檢測到辛酸乙酯。有趣的是，部分水果的果汁中未檢出辛酸和辛酸乙酯，但在相應的水果酒中卻檢出了辛酸乙酯。李凱等[33]在火龍果汁中未檢出辛酸和辛酸乙酯，但在火龍果發酵酒中卻檢出了辛酸乙酯。胡來麗等[34]在百香果汁中僅檢測到295.34 μg/L的辛酸乙酯，在百香果發酵酒中也檢測到了465.95 μg/L的辛酸乙酯。結果表明，無論在原材料中是否檢測到辛酸，酒精發酵過程中原材料并不是辛酸的唯一來源。

2.2 來源于釀酒酵母代謝的辛酸

研究表明，釀酒酵母的自身代謝可以產生辛酸，進而形成辛酸乙酯[35]。釀酒酵母中脂肪酸（辛酸是其中之一）的合成主要是在細胞質中的脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）I系統中完成，該系統是具有多酶活性的多結構域復合體[36]。釀酒酵母中脂肪酸的具體合成途徑如圖1所示[37-39]。來源于糖酵解途徑（glycolysis）的乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）是脂肪酸合成的初始單位，丙二酰CoA是二碳供應單位。乙酰CoA羧化酶（acetyl-CoA carboxylase）催化乙酰CoA合成丙二酰CoA，然后在酰基轉移酶（acyltransferase）作用下，乙酰CoA和丙二酰CoA分別將酰基部分轉移到酰基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP），隨后，二者在酮基合成酶（ketosynthase）的催化下脫羧縮合，形成酰基載體蛋白結合的β-酮酰基中間體。縮合后，β-酮酰基中間體通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴型酮基還原酶（ketoreductase）、脫水酶（dehydratase）以及另一種NADPH依賴型烯酰基還原酶（enoylreductase）的依次處理，得到完全飽和的酰基中間體。最終特定鏈長的脂肪酸主要通過底物特異性硫酯酶（thioesterase）來水解相應鏈長的酯酰ACP得到，即短、中、長鏈脂肪酸。

圖1 釀酒酵母細胞內脂肪酸的合成途徑Fig.1 Synthesis pathway of fatty acids in Saccharomyces cerevisiae

辛酸及其相應的中鏈脂肪酸在生物燃料[40]、功能性食品[41]、醫藥行業和飼料[42]等行業具有廣泛應用，促使通過改造釀酒酵母的辛酸/中鏈脂肪酸的合成途徑[43]達到高產目的成為釀酒酵母的研究熱點。乙酰CoA羧化酶催化乙酰CoA合成丙二酰CoA是脂肪酸合成途徑的限速步驟。當前針對釀酒酵母高產辛酸/中鏈脂肪酸的基因改造主要集中在該限速步驟和FAS I系統[43]。研究顯示，酵母中同時表達人類的hFAS△TE基因、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的PPT基因和兔的TE II基因，可提高短鏈脂肪酸產量達64倍，其中辛酸產量達到82 mg/L，己酸和癸酸的總量達到111 mg/L[44]。酵母菌FAS的丙二酰棕櫚酰轉移酶（malonyl palmitoyl transferase，MPT）結構域上的精氨酸和賴氨酸交換位置（'R1834K'）即形成酵母突變體FAS。在該突變體中，當丙二酰CoA減少時，短酰基鏈（如八酰基CoA）先釋放出來，然后通過硫酯酶水解八酰基CoA，即可釋放游離的辛酸[45-46]。通過該基因工程途徑，在面包酵母中辛酸產量可高達245 mg/L[46]。無論是野生菌株或是工程菌株，釀酒酵母均可發酵產辛酸/中鏈脂肪酸，不同菌株的產量有極大差異。有學者認為，通過改造脂肪酸的合成途徑提高短中鏈脂肪酸及其衍生物的產量是將來研究的方向[43]。實際上，按照該邏輯，由于中鏈脂肪酸（辛酸）對釀酒酵母具有毒性，因此隨著中鏈脂肪酸產量的增加，如何提高釀酒酵母對中鏈脂肪酸（辛酸）的耐受性是另一個非常重要的科學問題。

3 釀酒酵母對辛酸脅迫的應答機制

3.1 增加細胞膜的通透性

LIU P等[47]在研究己酸、辛酸和癸酸對釀酒酵母生長的影響時發現，當辛酸濃度＞1 mmol/L時，釀酒酵母的生長完全受到抑制，而且毒性隨著脂肪酸鏈的增加和培養基pH值的下降而提高，芯片數據顯示，辛酸的攻擊可能降低了釀酒酵母細胞膜的完整性，這種完整性的降低雖然對細胞膜的流動性沒有影響，但是直接使得細胞膜的通透性增加。眾所周知，細胞膜是具有高度選擇性的，倘若細胞膜的通透性增加，意味著更多的物質能夠進出細胞，可能給細胞帶來更大的傷害，因此，辛酸使細胞的通透性增加更確切的說是一種損傷而非應答解決問題的機制。同時，也有學者研究發現，向培養基中添加油酸能提高酵母細胞對辛酸的耐受性，可以降低細胞膜的通透性[47]。BESADA-LOMBANA P B等[48]將釀酒酵母乙酰CoA羧化酶1157位的絲氨酸替換為丙氨酸后阻止了該位點的磷酸化，將該基因在菌株BY4741中表達后，菌株的油酸產量提高了3.1倍（無辛酸脅迫）或1.6倍（有辛酸脅迫），在0.9 mmol/L的辛酸下脅迫24 h，該菌株的密度比原始菌株要高10倍多，這為避免添加外源油酸來降低細胞膜的通透性提供了新思路。

實際上，在利用釀酒酵母生產生物燃料的過程中，添加油酸來緩解膜的通透性是不夠的，因此，近年來多位學者嘗試從基因工程的角度來改造釀酒酵母，使其具備高濃度的中鏈脂肪酸的耐受性。LIU H等[49]在釀酒酵母中共表達了Lem3和Sfk1基因（二者均是膜不對稱調節因子），從而重塑了膜磷脂的分布，使得腦磷脂在質膜內葉中的積累量增加，進而使得膜電位和完整性分別提高了131.5%和29.2%，在應對己酸、辛酸和癸酸的脅迫下，OD600nm值分別提高了79.6%、73.4%和57.7%。另外，釀酒酵母生成的中鏈脂肪酸能否全部排放至發酵液中與細胞壁的厚度與滲漏性有關。WANG J J等[50]在拉格酵母中利用自克隆技術破壞掉β-1,3-葡聚糖合成酶的催化亞基（fks1）后，增加了細胞壁的厚度，使得辛酸和癸酸滲出量分別減少了39.9%和63.41%，因此，通過改變酵母細胞壁的厚度可控制胞內中鏈脂肪酸的滲出量。

3.2 升高H+-ATP酶的活性

研究表明，在含4～50 mg/L辛酸的條件下培養的釀酒酵母IGC 3507III的質膜腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）酶活性是無辛酸加入的1.5倍，當從培養基中去除辛酸后，這種情況迅速逆轉[51]。H+-ATP酶活性的升高與其編碼基因PMA1相關，低濃度辛酸對H+-ATP酶具有激活作用，同時可以觀察到PMA1的表達量也得到了提高[52]。這種酶活性的提高往往在指數生長早期達到最大值，H+-ATP酶活性激活直接與pH下降有關，并且能觀察到因pH值的下降而使細胞的活力受到損害[53]。在辛酸亞致死濃度下對釀酒酵母進行馴化或者是將釀酒酵母細胞短暫的（1 h）置于輕度辛酸脅迫條件下，可以使釀酒酵母獲得對辛酸致死濃度的抗性，這種適應性可能來自于質膜轉運蛋白受到誘導后介導鋅酸鹽主動流出細胞所致，另外將釀酒酵母細胞短暫置于輕度乙醇脅迫下也可提高釀酒酵母對辛酸的抗性，但是這種交叉響應獲得的抗性要低于上述水平，進一步的研究發現，無論是短暫的使用辛酸脅迫還是乙醇脅迫均能激活質膜上的H+-ATP酶的活性[54]。

學者們對釀酒酵母在辛酸脅迫下H+-ATP酶活性升高的機理進行了總結歸納，認為辛酸的質子和陰離子在細胞質釋放后，不能穿過細胞膜的疏水雙分子層而滯留在細胞內，使得細胞內積累高濃度的質子而酸化，為了抵抗胞內酸化，酵母細胞會增加H+-ATP酶的活性，排出高濃度的質子，導致大量能量喪失，由于胞質的低pH值，排出的質子會和陰離子重新結合，再次穿過細胞膜進入細胞內，從而形成循環，導致細胞內的能量不斷被消耗，隨著時間的增加，細胞內pH值（intracellular pH，pHi）不能維持在正常的生理pH水平[20，55]。因此H+-ATP酶活性的提高可能是釀酒酵母應對辛酸脅迫的一種應對機制，但是目前針對單一的辛酸對釀酒酵母的脅迫研究暫未見報道，需要進一步研究。

4 結論與展望

釀酒酵母最適pH范圍為4.5～5.0，而酒類釀造過程中所控制的pH值為3.0～3.6，因此，必然產生低pH值（高酸）脅迫[11]。酒精發酵過程中，高濃度的辛酸抑制了釀酒酵母的生長。釀酒酵母肯定具有一套完善的辛酸脅迫響應機制，但是目前知之甚少，已有報道的增加細胞膜通透性以及升高H+-ATP酶活性的機制需要進一步驗證。辛酸作為生產生活中廣泛應用的產品，僅從棕櫚油和椰子油中獲取既不環保也不利于可持續發展，基于代謝途徑改造從微生物中獲取的策略是獲取辛酸的可行路徑，然而由于辛酸的毒性，獲得辛酸高耐受性菌株對于高產辛酸的獲得就顯得尤為重要。以上均建立在釀酒酵母響應辛酸脅迫機制完全解析的基礎之上，因此對該問題的闡釋對于解決酒精發酵中的遲滯、開發辛酸高耐受性工程菌株以及獲得具有特殊需求的高密度發酵菌株，推動乙醇生產行業和清潔能源產業的發展具有重要意義，同時對于其他脂肪酸的研究也具有重要的參考價值。