釀酒酵母對無醇啤酒釀造特性及風味的影響

佟恩杰，李小燕，趙 凱，李 慧，陳文波，楊海鶯，盧 玉，杜以俊*

（1.中糧麥芽（大連）有限公司，遼寧 大連 116200；2.中糧營養健康研究院有限公司 老年營養食品研究北京市工程實驗室，營養健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209；3.南京財經大學 食品科學與工程學院 江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇 南京 210023；4.中糧糧谷控股有限公司，北京 100020）

無醇、低醇啤酒指不含酒精或酒精含量甚微的啤酒，在我國一般認為酒精度低于0.5%vol為無醇啤酒[1-2]。無醇啤酒最早由瑞士推出，隨后德國、美國、英國、日本等國家相繼開發出同類產品并占據了一定的市場份額[3]。在我國，年輕人、運動員、司機、酒精不耐受人群等消費者對無醇啤酒的需求也不斷增加[4]。

無醇啤酒生產方法很多，核心可以分為在發酵階段控制酒精的產生和發酵后對酒精成分的去除或減少[5]。發酵后去除酒精是目前市場上大多數無醇啤酒產品的生產方法，通常采用低溫蒸餾方法或反滲透法等，但存在工藝復雜、能耗高及啤酒風味發生改變等問題[6]?？刂凭凭a生的方法包括使用特殊的發酵酵母菌株、高溫糖化麥汁、低溫發酵等。在發酵階段控制酒精的產生優點是無需額外的設備投資，缺點在于糖化或發酵工藝發生變化且工藝控制要求高[7]。因此，選育無醇啤酒酵母開發無醇啤酒是目前的研究熱點[8]。宋剛等[9]以自行構建的工程菌株為發酵菌株，進行無醇啤酒發酵的初步探索，并進行1 t發酵罐密閉發酵工藝試驗，可使發酵液乙醇含量低于1%；劉楊等[10]使用路德類酵母生產無醇啤酒，當原麥汁濃度低于8°P 時，酒精度可達到低于0.5%vol的無醇啤酒要求；康虹等[11]利用假絲酵母開發無醇啤酒，能產生具有杏仁風味的水楊醛。上述研究表明選育無醇啤酒酵母開發無醇啤酒的可行性，但無論工程菌、路德類酵母還是假絲酵母，與啤酒工業普遍使用的釀酒酵母都有所區別，商業化生產應用未見報道。

本研究利用實驗室保藏無醇釀酒酵母和商業對照無醇釀酒酵母，以特種麥芽為釀造原料，采用普通啤酒發酵工藝，研究釀酒酵母對無醇啤酒釀造特性及風味的影響。通過測定不同酵母的啤酒發酵性能、麥汁糖發酵利用率、酒精轉化能力及所釀啤酒的理化指標，并采用頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase micro-extraction，HS-SPME）和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用法分析不同酵母釀造啤酒風味物質的差異性，最終選出適合無醇啤酒釀造的釀酒酵母菌種，以期為簡化無醇啤酒生產工藝，釀造高品質的無醇啤酒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

特種麥芽：使用進口大麥，采用特殊制麥工藝、特殊設備制成的具有較低可發酵性糖的特種麥芽，中糧麥芽（大連）有限公司。

商業對照無醇啤酒活性干酵母：法國弗曼迪斯酵母有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y272、Y273、Y274，本實驗室-80 ℃甘油管冷凍保藏。

酒花：薩茲（Saaz）和亞麻黃（Amarillo），市售。

1.1.2 化學試劑

酵母粉、蛋白胨、瓊脂（均為生化試劑）：北京陸橋技術有限責任公司；葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、麥芽三糖（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、氯化鈉、濃硫酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；1,2,3-三氯丙烷（色譜純）：北京曼哈格生物科技有限公司；正構烷烴（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）瓊脂培養基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。調節pH 6.0，于121 ℃滅菌20 min，備用。

麥汁培養基：8°P麥汁，自然pH值[10]，115 ℃滅菌20 min，備用。

1.2 儀器與設備

N812C低溫恒溫培養箱、SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器：日本YAMATO公司；THZ-100恒溫培養搖床：上海一恒科學儀器有限公司；HDZS60-D啤酒釀酒生產線：哈爾濱漢德輕工醫藥裝備有限責任公司；ME203天平：美國梅特勒公司；PB-10酸度計：德國賽多利斯公司；DMA 4500M密度儀：奧地利Anton Paar公司；LA-20AT高效液相色譜儀、Nexis GC-2030氣相色譜儀（配HSS-30A頂空進樣器、火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）、ECD檢測器）、GCMS-2020NX氣相色譜質譜聯用儀（AOC-6000多功能自動進樣器）：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母活化

取甘油凍存管保藏的釀酒酵母菌液1環接種于YPD斜面培養基，25 ℃培養72 h后，活化擴培參考孫可澄等[12]的方法。市售無醇啤酒活性干酵母（1.0×1010CFU/g）活化使用10倍于酵母質量的無菌水，25～29 ℃保持15～30 min后使用。

1.3.2 啤酒釀造工藝流程及操作要點

麥芽→粉碎→糖化→過濾→煮沸→過濾→麥汁濃度調整→接種酵母→發酵→后熟→無醇啤酒原液

操作要點：

麥芽粉碎：調節麥芽粉碎機對輥間距，控制麥芽粉碎度為1.0 mm。

麥汁制備：將麥芽粉與水按料液比1∶5（g∶mL）混合均勻，65 ℃糖化60 min后過濾，煮沸濾液，煮沸過程添加酒花，添加量為0.02%。煮沸后趁熱過濾，調整麥汁濃度至8°P備用。

實驗室模擬啤酒發酵：使用滅菌的1 L三角瓶分裝麥汁，裝液量100 mL/250 mL。將活化酵母接種于麥汁，使酵母活菌數約為1×106CFU/mL。使用透氣封口膜或添加有濃H2SO4的發酵栓封口。靜置培養，培養溫度為18 ℃。麥汁接種前、接種后，以及發酵過程中，透氣封口膜封口，樣品每天取樣，發酵栓封口樣品每天早晚兩次稱質量并記錄，單日質量損失低于0.1 g/400 mL代表發酵結束。發酵結束后將發酵上清液轉入無菌啤酒瓶，0～4 ℃后熟，得到無醇啤酒原液。

30 L啤酒發酵罐發酵：將擴培酵母泥接種到麥汁中，接種后酵母活菌數約為1×106CFU/mL，發酵溫度為18 ℃，發酵過程中使用密度儀測定麥汁的密度變化情況，當密度連續2 d不再發生變化時認為發酵結束。發酵結束后，降低發酵罐溫度至0～4 ℃，進入后熟階段。待酵母沉降完畢時，無明顯雙乙酰氣味，完成無醇啤酒的釀造。

1.3.3 酵母生長測定

發酵液梯度稀釋后涂布于YPD平板，28 ℃培養72 h后計算活菌數。

1.3.4 酵母可發酵性糖檢測

無菌取麥汁、發酵液及啤酒的上層液，以0.45 μm孔徑的濾膜進行過濾得到待測液，按李慧等[13]的方法檢測。色譜柱：Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm），柱溫：65 ℃；流動相0.005 mol/L H2SO4，流速0.60 mL/min；檢測器為示差檢測器，進樣量為20 μL。

1.3.5 麥汁發酵液及啤酒理化指標檢測

酒精度：根據團體標準T/CBJ 3108—2021《無醇啤酒》進行檢測[2]；雙乙酰、總酸、原麥汁濃度、發酵度：根據國標GB/T4928—2008《啤酒分析方法》進行檢測[14]；糖度、比重：使用DMA 4500M密度儀檢測；pH值：采用pH酸度計檢測；表觀發酵度：參考《啤酒工業》手冊[15]。

1.3.6 無醇啤酒揮發性化合物檢測

（1）樣品前處理

取5 mL啤酒樣品至20 mL螺口頂空進樣瓶，準確加入1,2,3-三氯丙烷（10 mg/L）內標溶液150 μL，加密封墊、鋁蓋壓緊搖勻。將準備好的頂空測試樣品，放置于頂空固相微萃取自動進樣系統，60 ℃恒溫振蕩10 min，待頂空風味物質濃度達到平衡后插入固相微萃取探針，萃取30 min后拔出，插入進樣口，脫附3 min[16]。

（2）氣相色譜條件

參考VIEIRA A C等[17-18]的方法，色譜柱：DB-WAX 57CB（50 m×0.25 mm，0.2 μm）；載氣：99.999%高純度氦氣（He），載氣流速1 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；解吸時間1 min；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min速度上升到150 ℃，隨后以4 ℃/min速度上升到230 ℃，保持8 min；進樣量1 μL，不分流進樣；溶劑延遲時間2 min。

（3）質譜條件

電離模式：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；掃描方式：質譜掃描范圍：30～500 m/z。

（4）定性定量分析方法

通過GC-MS檢測分析啤酒揮發性化合物總離子流圖，自動識別信噪比（S/N）＞200的色譜峰，運用美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）14譜庫與樣品色譜峰進行比對分析，篩選得到匹配度＞80%的物質，并結合保留指數（retention index，RI）進行定性分析，計算值與文獻值差值＜50。以1,2,3-三氯丙烷作為內標物，計算各揮發性化合物質量濃度（mg/L）。

1.3.7 風味化合物氣味活度值分析

與文獻報道的揮發性化合物香氣特征進行比對，篩選風味化合物，根據啤酒中風味化合物的質量濃度及各物質的香氣閾值，計算各風味化合物的氣味活度值（odor activity value，OAV）[19-20]。

1.3.8 感官評價

發酵結束后，組織專業培訓的品評人員組成感官分析品嘗小組，參考T/CBJ 3108—2021《無醇啤酒》[2]及GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[14]對啤酒的香氣、口感及有無明顯缺陷等方面進行感官分析。

1.3.9 數據處理

所有的試驗進行3次，使用Microsoft Excel 2013進行數據分析，數據為“平均值±標準差”，使用OriginPro 2019軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 實驗室模擬啤酒發酵過程酵母麥汁發酵速率及生長曲線

不同釀酒酵母在實驗室模擬啤酒發酵過程中，CO2質量損失變化及酵母生長曲線見圖1。

圖1 不同酵母麥汁發酵過程中CO2質量損失變化及酵母生長曲線Fig.1 Changes of CO2 mass loss and growth curve during wort fermentation process with different yeasts

如圖1可知，以商業無醇釀酒酵母為對照，3株實驗室保藏無醇釀酒酵母表現出了較好的生長及發酵性能。酵母Y272、Y273和商業對照無醇釀酒酵母在麥汁中發酵第1天開始進入穩定期，細胞數分別增殖到1.0×108CFU/mL、1.0×108CFU/mL和1.2×108CFU/mL，此時，CO2每日質量損失分別為0.31 g/400 mL、0.29 g/400 mL和0.52 g/400 mL。酵母Y274發酵到第3天才開始進入穩定期，此時，CO2每日質量損失為0.54 g/400 mL。酵母Y272、Y273生長速度和起始發酵速度快，酵母Y274生長速度和起始發酵速度慢。

2.2 實驗室模擬啤酒發酵麥汁糖的利用

用酵母消耗糖的質量濃度與麥汁初始糖的質量濃度的百分比表示酵母麥汁發酵糖的利用率，不同酵母對麥汁中不同糖的利用結果見表1。

表1 實驗室模擬啤酒發酵麥汁中不同酵母對糖的利用率Table 1 Utilization rate of sugar in fermented wort of beer simulated by different yeasts in laboratory

由表1可知，原麥汁果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽三糖的質量濃度較低，麥芽糖和異麥芽糖的濃度較高。3株實驗室保藏無醇釀酒酵母和和商業對照無醇釀酒酵母對果糖、葡萄糖和蔗糖的利用率很高，均可達到86%以上，但基本不利用麥芽糖、異麥芽糖和麥芽三糖。這與路德類酵母對麥汁中糖的利用率結果相似[10]。

2.3 不同釀酒酵母對實驗室模擬發酵啤酒理化指標的影響

發酵結束后，對不同菌株發酵啤酒的理化指標進行檢測，結果見表2。

表2 不同酵母實驗室模擬發酵啤酒的理化指標Table 2 Physicochemical indexes of different beer samples brewed by different yeasts in laboratory

由表2可知，與商業對照酵母相比，3株實驗室保藏無醇釀酒酵母的發酵度較低，為17%左右，產生的酒精度低，分別為0.52%vol（商業對照）、0.43%vol（Y272）、0.48%vol（Y273）及0.49%vol（Y274）。發酵啤酒的pH值較高，為4.75左右，這與發酵產生的酸較少有關。同時，發酵啤酒中的雙乙酰含量＜0.05 mg/L，在啤酒雙乙酰的風味閾值（0.1 mg/L）之內。3株實驗室保藏無醇釀酒酵母釀造啤酒的理化指標均滿足無醇啤酒標準要求[3]，可用于無醇啤酒釀造。

2.4 不同釀酒酵母對實驗室模擬發酵啤酒風味化合物的影響

采用HS-SPME/GC-MS法檢測不同釀酒酵母實驗室模擬發酵啤酒中的揮發性化合物，測定啤酒中揮發性化合物的含量并計算OAV，分析結果見表3。

表3 不同啤酒揮發性化合物的組成及含量Table 3 Composition and contents of volatile compounds in different beer samples produced with different yeasts

由表3可知，4種啤酒（實驗室保藏無醇釀酒酵母Y272、Y273、Y274及商業對照無醇酵母釀造啤酒）中共檢測出92種揮發性化合物，分別為47種、49種、49種及48種。以酯類化合物和醇類化合物含量最高，酵母Y272釀造啤酒還富含醛類化合物。與文獻報道的揮發性化合物香氣特征進行比對，從HS-SPME/GC-MS揮發性化合物分析結果中篩選OAV≥1的風味化合物[21]，結果表明，4種啤酒共篩選出OAV≥1的酯類化合物12種，醇類化合物4種，醛類化合物5種，酸類化合物2種，酮類化合物2種，其他類化合物2種。

酯類化合物是啤酒的重要風味物質，也是啤酒香氣的主要載體，主要在主發酵期間形成[22-23]。由表3可知，4種啤酒中OAV均≥1的酯類化合物有8種，其中，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸甲酯、癸酸乙酯OAV均較高，賦予酒體花香味（橙花、茉莉花、玫瑰花）、果味（菠蘿、柑橘、梨）、酒味等氣味特征。與商業對照無醇釀酒酵母相比，癸酸甲酯是3種實驗室保藏無醇釀酒酵母釀造的啤酒最具有香氣活性的風味物質，賦予酒樣濃郁的脂香和果香味，尤其酵母Y274釀造的啤酒（癸酸甲酯OAV為1 090.87）。乙酸苯乙酯也是3種實驗室保藏無醇釀酒酵母釀造啤酒的特有的OAV＞1的風味物質，賦予酒樣甜味、蜂蜜味、玫瑰花香味。

醇類化合物是啤酒的基本風味物質，對啤酒風味有重大影響，絕大部分來源于酵母發酵過程中的氨基酸代謝或糖代謝，也是某些酯類物質的前體物質[24]。4種啤酒中的OAV均＞1的醇類化合物有3種，分別為（±）-2-甲基-1-丁醇、1-癸醇和苯乙醇，賦予啤酒花香味（玫瑰）、果味（柑橘）、酒味（葡萄酒）、香料味（丁香）、蜂蜜味、脂肪味、青草味、洋蔥味。與商業對照酵母相比，酵母Y272、Y274釀造的啤酒中異戊醇的OAV＞1，帶給啤酒威士忌味，麥芽味，燒焦味。

醇類和酯類是啤酒風味物質中最主要的組成部分[13]，醇酯比是評價啤酒風味特點的重要依據，一般醇酯比在3～4較理想，但目前多數啤酒偏低[13]。從表3可以看出，酵母Y272、Y274和商業對照無醇酵母釀造啤酒的醇酯比在1～2之間，酵母Y273釀造啤酒的醇酯比為2.64，接近3～4的理想醇酯比例，這有助于啤酒風味和香氣的協調性。

醛類物質普遍具有強烈的氣味特征[25]，新鮮啤酒中的醛類化合物主要形成于麥汁或酵母釀造過程，4種啤酒OAV＞1的醛類物質各有不同。2-甲基丁醛、異戊醛和十二醛是酵母Y272釀造啤酒的主要醛類風味化合物，呈現可可味，杏仁味，麥芽味，柑橘味，肥皂味，蠟味；苯乙醛是酵母Y273釀造啤酒的主要醛類風味化合物，呈現山楂味，蜂蜜味，甜味；異戊醛、十二醛是酵母Y274釀造啤酒的主要醛類風味化合物，呈現麥芽味；2-甲基丁醛是商業對照無醇酵母釀造啤酒的主要醛類風味化合物，呈現可可味，杏仁味。

除此之外，4種酒樣中的酸類、酮類和其他類揮發性化合物也有OAV＞1的風味化合物，這些物質對啤酒的香氣起到比較重要的補充和修飾作用。其中，大馬士酮在3種啤酒中的OAV＞5 000（酵母Y272、Y273及商業對照無醇酵母釀造啤酒），賦予啤酒馥郁的蘋果味，玫瑰味及蜂蜜味。綜上所述，酵母Y273釀造啤酒的風味化合物種類豐富，香氣特點突出。

2.5 實驗室模擬發酵啤酒感官評價

對實驗室模擬發酵啤酒的香氣、口感及有無明顯缺陷予以感官評價，根據品評記錄得分繪制風味雷達圖，結果見圖2。

圖2 不同酵母釀造啤酒風味品評結果雷達圖Fig.2 Radar chart of flavor evaluation results of different beer samples brewed by different yeasts

由圖2可知，從風味來看，4種啤酒無明顯缺陷型香氣，酒花香氣明顯。與商業對照無醇釀酒酵母相比，酵母Y272、Y273釀造的啤酒果香突出，分值分別為2.87和2.84。尤其酵母Y273釀造的啤酒花香、果香細膩協調，這與該酵母釀造啤酒具有相對豐富的酯類、醇類和醛類等化合物及較好的醇酯比例（2.64）有一定的關系。從口味來看，4種啤酒無明顯異味，有殺口感。從酒體飽滿度來看，酵母Y273釀造的啤酒酒體飽滿度分值最高，為1.92。綜合評價，酵母Y273釀造的啤酒風味協調，純正爽口，酒體飽滿，適合釀造無醇啤酒。

2.6 釀酒酵母發酵罐啤酒發酵穩定性驗證

綜合發酵速率、啤酒理化指標、風味化合物分析及感官評價結果，選擇釀酒酵母菌株Y273采用30 L發酵罐進行啤酒釀造放大試驗，結果見表4。

由表4可知，酵母Y273發酵罐釀造啤酒的酒精度滿足T/CBJ 3108—2021《無醇啤酒》要求[2]，雙乙酰含量符合GB/T 4927—2008《啤酒》要求[1]。說明這株菌可在發酵罐中放大發酵，具有非常好的無醇啤酒釀造應用潛力。

3 結論

本研究選用3株實驗室保藏無醇釀酒酵母與商業對照無醇釀酒酵母及特種麥芽，使用普通啤酒發酵工藝，研究釀酒酵母釀造無醇啤酒的發酵性能、釀酒酵母對可發酵性糖的利用率，并對所釀啤酒的理化指標進行檢測，同時采用HS-SPME/GC-MS分析比較不同酵母釀造啤酒的風味差異。結果表明，相比較其他兩株實驗室保藏無醇釀酒酵母及商業對照無醇釀酒酵母，酵母Y273發酵性能好，可發酵性糖利用率為18.55%，所釀啤酒理化指標適中，酒精度0.48%vol，表觀發酵度17.21%，pH值為4.76。該酵母所釀造的啤酒風味物質多樣，醇酯比例協調，感官評價香氣細膩協調。最終確定酵母Y273比較適合釀造無醇啤酒。