河套地區中溫大曲細菌菌群多樣性解析及其風味品質評價

鄒 銓，張 敏，李 擎，郭 壯，王玉榮*

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.內蒙古河套酒業集團股份有限公司，內蒙古 巴彥淖爾 015400）

中國白酒的傳統工藝主要包括大曲制備、淀粉糖化、酒精發酵、固態蒸餾和陳化[1]。白酒發酵過程中的品質與釀酒大曲微生物類群、釀酒原材料和釀造工藝息息相關[2]。大曲是中國傳統白酒發酵曲的一種，在白酒發酵過程中作為微生物載體之一，主要以高粱、大麥或豌豆等谷物為原料，經過潤糧粉碎、原料堆積、曲塊成型、固態培養和成熟干燥等步驟制成，可為白酒發酵提供豐富的微生物群和酶系，進而影響發酵過程中乙醇和風味的產生，對白酒的質量有著決定性作用[3-4]。細菌是大曲微生物群落中的重要類群之一，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）可以分泌多種酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，對大曲中微生物群落的調節和風味化合物的生產具有重要作用[5]。因此，解析大曲中細菌類群，探究Bacillus分布情況對白酒品質的改善具有重要意義。

高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術具有通量高、測序快且無需培養的優點，可以有效對樣品中屬水平及其以上分類學地位的微生物進行解析與注釋，許多學者利用HTS技術解析釀酒大曲中微生物群落結構，對大曲中微生物資源的開發與利用提供了參考與指導[6-7]。風味是評價白酒質量的關鍵指標，電子鼻則是模擬動物嗅覺器官開發的一種快速識別食品氣味的儀器，利用電子傳感器陣列的響應值提供樣品的風味信息[8]，具有操作簡單、分析快速、成本低及結果直觀的優點，對食品風味的解析及品質的改善具有重要作用，現已廣泛應用于發酵食品和飲料研究中[9]。因此，通過HTS和電子鼻技術聯合，解析大曲中微生物多樣性和風味物質對改善大曲品質具有明顯的優勢。

內蒙古自治區以溫帶大陸性氣候為主，地理環境和水資源獨特[10]。基于此，本研究使用Illumina MiSeq高通量測序技術對采集自內蒙古河套地區中溫大曲的細菌菌群多樣性進行分析，采用電子鼻技術對大曲風味品質進行分析，并對優勢菌屬和風味品質之間的相關性進行解析與探討，然后采用PICRUSt軟件對菌群基因功能進行預測，同時結合可培養技術對大曲中芽孢桿菌進行分離鑒定，以期為進一步解析內蒙古地區中溫大曲微生物結構和品質提供參考，從而為改善大曲品質提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中溫大曲樣品：內蒙古自治區河套地區H酒廠；DNeasy mericon Food Kit脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：Axygen生物技術（杭州）有限公司；引物338F/806R、27F/1495R、M13F（-47）/M13R（-48）：武漢天一輝遠生物科技有限公司；5×TransStartTMFastPfu Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）、FastPfu Fly DNA Polymerase、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、2×PCR Buffer、rTaq酶和克隆載體pMDR18-T Vector：寶生物工程大連有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）top10感受態細胞：湖北省食品配料工程技術研究中心制備；營養瓊脂（nutrient agar，NA）培養基：青島海博生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BF-10小型高速粉碎機：河北本辰科技有限公司；5810R型離心機（冷凍型）：德國Eppendorf公司；DYY-12型電泳儀：北京六一儀器廠；veritiFAST梯度PCR擴增儀：美國AB公司；Fluor Chem FC3型化學發光凝膠成像系統：美國Protein Simple公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；R920型機架式服務器：美國DELL公司；PEN3電子鼻：德國Airsense公司；HR40-IIB2生物安全柜：海爾集團電子商務有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中溫大曲樣品采集和預處理

中溫大曲樣品于2022年10月采集自河套地區（111°45′20″E、39°54′39″N）H酒廠的制曲車間，以優質冬小麥為制曲原料，經過潤糧、粉碎、拌料壓曲、入房臥曲、培曲翻曲和入庫貯存等工藝制成[11]，選擇同一批次、相同條件下制備的無斷裂[12]、表面無霉斑、厚度適中、有特殊香氣[13]的中溫大曲曲塊共5份，編號為BMZW1～BMZW5。在實驗室條件下切割粉碎曲塊，并通過20目篩子處理大曲粉末，以獲取品質均一的大曲粉樣品，將樣品轉移到無菌自封袋于4 ℃貯存。

1.3.2 中溫大曲樣品宏基因組DNA提取、PCR擴增和Illumina MiSeq高通量測序

按照試劑盒說明書中的步驟，使用DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒對大曲樣品中宏基因組DNA進行提取，以其為模板，使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對檢測合格的宏基因組DNA的16S rRNA V3-V4區基因序列進行PCR擴增[14]，將合格的PCR擴增產物委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 序列質控和生物信息學分析

使用QIIME v1.9.1平臺對Illumina MiSeq測序返回的原始序列進行質量控制和生物信息學分析，具體分析流程包括：對齊并合并雙端序列，刪減低質量序列、引物序列和嵌合體序列[15]；劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[16]，通過RDPv11.5、Greengenev13.5和SILVA v132數據庫[17]進行細菌物種注釋；統計各樣品中細菌在門和屬水平的相對含量；計算相同測序深度下樣品的超1（Chao1）指數和香農（Shannon）指數[18]；使用PICRUSt軟件對中溫大曲中細菌菌群的基因功能進行預測[19]，參考蛋白質直系同源簇數據庫（clusters of orthologous groups of proteins，COGs）進行基因功能注釋[20]。

1.3.4 大曲風味品質分析

參考文獻[21]對中溫大曲樣品進行預處理，測量樣品前，以空氣為載體清潔注射針95 s，調零時間5 s，預備時間5 s，具體測量參數參考趙慧君等[22]的研究并略做調整。樣品測試時間為60 s，選取49 s、50 s和51 s時的測試響應值作為有效數據進行后續分析，每個樣品測試3個平行。

1.3.5 大曲中芽孢桿菌的分離及鑒定

分離與純化：取10 g大曲粉末加入到裝有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，置于37 ℃搖床中220 r/min振蕩30 min。采用梯度稀釋法和平板涂布法對樣品中可培養芽孢桿菌進行分離[23]，并通過平板劃線法對分離株進行多代純化[24]，根據菌落和細胞形態將純化菌株保藏于-80 ℃超低溫冰箱。

鑒定：參考文獻[25]提取分離株的DNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行檢測，將檢測合格的DNA進行PCR擴增、清潔、連接和轉化[26]，選取鑒定結果為陽性的單克隆委托上海桑尼生物科技有限公司進行測序，將返回的測序序列進行拼接與去引物后，提交至美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的Genbank數據庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對，明確分離株的分類學地位。

1.3.6 數據處理與可視化

使用Excel 2016進行數據處理，使用SAS軟件（v9.4）中的Spearman相關系數法計算優勢細菌屬和大曲風味物質之間的相關系數；使用R軟件繪制棒棒圖、瀑布圖和熱圖；使用jvenn（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）繪制韋恩圖；使用在線網站（https：//www.genescloud.cn/chart/chartOverview）繪制箱型圖；使用MEGA7軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）繪制系統發育樹，并采用R軟件包ggtree美化系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 中溫大曲樣品中細菌菌群多樣性及組成分析

對采集自河套地區的5份中溫大曲細菌菌群的16S rRNA V3-V4區域基因序列進行高通量測序，在測序量44 010 bp條件下獲得超1（Chao1）指數和香農（Shannon）指數，對樣品中細菌菌群的豐富度和多樣性進行解析，結果見圖1。

圖1 中溫大曲樣品中細菌菌群的超1指數（A）和香農指數（B）Fig.1 Chao 1 index (A) and shannon index (B) of bacterial groups in medium-temperature Daqu samples

由圖1可知，樣品BMZW1的超1指數和香農指數均最小，表明樣品BMZW1的細菌物種數最少且物種多樣性最低；樣品BMZW2的超1指數最大，樣品BMZW5的香農指數最大，表明樣品BMZW2細菌物種數最多，BMZW5細菌物種多樣性最高。由此表明，不同中溫大曲樣品之間細菌物種數和多樣性存在差異。

從不同中溫大曲樣品中選擇具有代表性的細菌OTU序列與數據庫進行同源性比對，完成OTU序列物種注釋。本研究將僅存在于其中一個樣品中的OTU稱為特有OTU，將存在于所有樣品中的OTU稱為核心OTU，將平均相對含量＞1%的核心OTU稱為核心優勢OTU。中溫大曲樣品中OTU分布及核心優勢OTU分析結果見圖2。

圖2 中溫大曲樣品的OTU韋恩圖（A）和核心優勢OTU瀑布圖（B）Fig.2 OTU Venn diagram (A) and waterfall diagram of core advantage OTU (B) of medium-temperature Daqu samples

由圖2A可知，中溫大曲樣品中共注釋到3 094個OTU，包含197 041條有效序列。樣品中共含有612個特有OTU，包含2 999條序列，占總測序量的1.52%；核心OTU有96個，包含173 246條序列，占總測序量的87.92%。由此表明，河套中溫大曲樣品中核心細菌總量占較大比重。

為進一步解析樣品中核心細菌類群，對核心優勢OTU進行數據可視化分析。由圖2B可知，核心優勢OTU相對含量為73.10%，包括隸屬于高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）（32.80%）的OTU2759，隸屬于魏斯氏菌屬（Weissella）（6.62%）的OTU4389，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus）（8.12%）的OTU4590、OTU167和OTU672，隸屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）（7.27%）的OTU1612、OTU4041和OTU384，隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）（3.01%）的OTU2631，隸屬于明串珠球菌屬（Leuconostoc）（1.54%）的OTU2985，隸屬于糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）（4.52%）的OTU1261，隸屬于放線多孢菌科（Actinopolysporaceae）（2.32%）的OTU22，隸屬于水桿菌屬（Aquabacterium）（3.48%）的OTU3988和OTU4795，隸屬于嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）（2.22%）的OTU578和隸屬于青枯菌屬（Ralstonia）（1.21%）的OTU1271。綜上表明，河套中溫大曲樣品中優勢菌群類群豐富且相對含量較高。

為進一步解析不同樣品中核心細菌類群，基于細菌門和屬水平對樣品中細菌群落進行分析。其中，本研究將樣品中平均相對含量＞1%的細菌門和屬稱為優勢細菌門和屬，各樣品中細菌門、屬分布見圖3。

圖3 基于門（A）和屬（B）水平中溫大曲樣品中細菌菌群結構Fig.3 Bacterial community structure of medium-temperature Daqu samples based on phylum (A) and genus (B) levels

由圖3A可知，中溫大曲樣品中優勢細菌門主要隸屬于厚壁菌門（Firmicutes）（73.23%）、放線菌門（Actinobacteria）（12.85%）和變形菌門（Proteobacteria）（12.56%），累計平均相對含量達98.64%。Firmicutes是大曲中具有絕對優勢的細菌類群，由此可推測，本研究河套中溫大曲的生產工藝、制曲原料等條件更適合Firmicutes類細菌的富集。

由圖3B可知，中溫大曲樣品中優勢細菌屬有11個，分別為Thermoactinomyces、Lactobacillus、Staphylococcus、Saccharopolyspora、Weissella、Aquabacterium、Bacillus、Pelomonas、Leuconostoc、片球菌屬（Pediococcus）和Ralstonia，平均相對含量分別為35.88%、12.29%、10.36%、10.07%、6.82%、3.78%、3.33%、2.22%、2 07%、1.28%和1.21%。馮佳婷等[27]通過對瀘州老窖大曲微生物群落結構進行分析顯示，Bacillus（63.53%）、Thermoactinomyces（7.0%）和Saccharopolyspora（9.7%）是高溫曲中高豐度菌群，Lactobacillus（35.8%）、Weissella（35.9%）和Thermoactinomyces（13.77%）是中溫曲中高豐度菌群。與本研究結論相比，釀酒大曲中菌群構成具有一定的相似性，但菌群豐度受到制曲溫度、地域條件等因素的影響存在差異。

2.2 中溫大曲樣品風味品質電子鼻分析

為進一步解析中溫大曲品質，本研究基于電子鼻技術對大曲樣品中的風味物質進行分析，結果見圖4。

圖4 中溫大曲樣品風味電子鼻分析結果Fig.4 Electronic nose analysis results of flavor of mediumtemperature Daqu samples

由圖4可知，W1W、W5S和W1S傳感器響應值較大，表明大曲樣品中含量較高的風味物質包括有機硫化物、萜類物質、氮氧化物和甲烷，其次為乙醇和烷烴等風味物質。此外，對芳香類物質靈敏的傳感器W1C、W3C和W5C的響應值偏低，表明大曲樣品中芳香類物質強度較低。

2.3 中溫大曲樣品風味品質與優勢細菌屬間相關性分析

為進一步探究大曲風味品質與優勢細菌屬之間的關聯性，本研究對其進行Spearman相關性分析，結果見圖5。

圖5 中溫大曲樣品風味品質與優勢細菌屬相關性分析熱圖Fig.5 Heatmap of correlation analysis between flavor quality and dominant bacterial genera in medium-temperature Daqu samples

由圖5可知，Bacillus與W3C和W5C呈顯著正相關（P＜0.05），與W5S呈顯著負相關（P＜0.05），與W1W呈極顯著負相關（P＜0.01），Saccharopolyspora與W2W呈顯著正相關（P＜0.05）。由此表明，Bacillus與大曲中有機硫化物、萜類物質、氮氧化物和芳香類物質等風味物質之間存在顯著相關性（P＜0.05），這可能與芽孢桿菌可以分泌多種酶有關[28]，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，對大曲中風味化合物的產生發揮重要作用。Saccharopolyspora與有機硫化物之間存在顯著相關性（P＜0.05），Saccharopolyspora中存在能產生抗生素、酶類、免疫抑制劑等生物活性物質的物種，是尋找新的生物活性物質的重要菌源[29]。

2.4 細菌菌群的基因功能預測分析

本研究使用PICRUSt軟件對大曲樣品中細菌菌群的基因功能進行預測，從而探索大曲微生物的潛在功能，所有細菌序列注釋到4 092個COG，分別隸屬于23個功能大類，結果見圖6。

由圖6可知，中溫大曲樣品中細菌菌群基因除了在轉錄、翻譯、核糖體結構與生物發生、復制、重組和修復等與自身生長繁殖功能相關方面具有較高豐度（25.15%），在氨基酸運輸與代謝、碳水化合物運輸與代謝和能源生產與轉換等營養物質生產與代謝功能上也呈現高豐度分布狀態，占總豐度的22.03%。由此表明，大曲中細菌群落在原料降解和風味物質代謝方面具有較大潛力，且樣品中細菌基因的生長繁殖功能具有較高豐度，伴隨著其能量產生與轉換功能具有較高的豐度。CAI W C等[30]研究顯示，大曲的發酵依賴氨基酸和碳水化合物的運輸與代謝，氨基酸作為微生物生長所需的氮源，影響微生物的生長和代謝，是大曲揮發性芳香物質產生的基礎，同時氨基酸與碳水化合物反應會賦予大曲獨特的香氣。大曲中的細菌還存在高豐度的一般功能預測和未知功能的基因，分別占總豐度的12.96%和10.16%。結合圖3B可知，大曲中存在一定豐度的未鑒定細菌屬，平均相對含量達6.58%。由此推測，樣品中未知功能的基因可能與這些未研究的細菌相關[31]。

2.5 中溫大曲樣品中芽孢桿菌的分離及鑒定

上述分析已表明，Bacillus是中溫大曲中的優勢菌群，與大曲中多種風味物質具有顯著相關性，為進一步解析中溫大曲中芽孢桿菌的分布情況，本研究對樣品中可培養芽孢桿菌進行分離純化。根據菌落形態、顏色、大小和邊緣情況，從大曲樣品中共分離純化出30株疑似芽孢桿菌菌株，并對分離菌株進行分子生物學鑒定，經同源性比對分析發現，分離菌株隸屬于7個種，其菌落形態和細胞形態見圖7。

圖7 7種分離菌株的菌落形態（A）和細胞形態（B）Fig.7 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of 7 isolated strains

由圖7可知，隸屬于不同種的芽孢桿菌其菌落形態呈現明顯差異，細胞形態均呈現桿狀，但菌體粗細和長短不盡相同。為進一步呈現30株分離菌株中芽孢桿菌的分布情況，構建系統發育樹分析，結果見圖8。

圖8 基于16S rRNA基因序列30株分離菌株的系統發育樹Fig.8 Phylogenetic tree of 30 isolated strains based on 16S rRNA gene sequence

由圖8可知，分離菌株與其對應標準菌株之間形成明顯的聚類樹形，且位于同一聚類的分離株與標準菌株之間的相似度均≥99%。由此表明，30株分離菌株被鑒定為7個細菌種。其中，14株被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），占總分離株數的36.67%，為大曲中可培養芽孢桿菌的第一大優勢菌種。8株被鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），占總分離株數的26.67%，為第二大優勢菌種。3株被鑒定為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis），2株被鑒定為假蕈狀芽孢桿菌（Bacillus pseudomycoides），其余3株分別被鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、索諾氏芽孢桿菌（Bacillus sonorensis）和副地衣芽孢桿菌（Bacillus paralicheniformis）。不同芽孢桿菌可在大曲發酵中影響其特征風味物質的合成，HE G Q等[32]研究顯示，接種Bacillus subtilis和Bacillus velezensis可以增加大曲中己酸、己酸乙酯和己酸己基酯等風味代謝物的含量，改善大曲品質。XU B Y等[33]研究表明，接種Bacillus licheniformis和Bacillus velezensis可以改變大曲中微生物豐度，控制微生物代謝，使大曲中醇類、酸類和酮類等風味物質的含量有所提高。

3 結論

納入研究的河套中溫大曲樣品細菌菌群豐富，優勢細菌門包括Firmicutes、Actinobacteria和Proteobacteria，優勢細菌屬主要隸屬于Thermoactinomyces、Lactobacillus、Staphylococcus、Saccharopolyspora、Weissella、Aquabacteri um、Bacillus、Pelomonas、Leuconostoc、Pediococcus和Ralstonia。其中，Bacillus與有機硫化物、萜類物質、氮氧化物和芳香類物質之間存在顯著相關性（P＜0.05），Saccharopolyspora與有機硫化物呈顯著正相關（P＜0.05），且細菌菌群基因在氨基酸運輸與代謝、碳水化合物運輸與代謝和能源生產與轉換功能上有較高豐度。大曲中可培養芽孢桿菌種類豐富，分離的30株芽孢桿菌分別隸屬于7個種，其中Bacillus subtilis（36.67%）和Bacillus licheniformis（26.67%）相對含量較高，對大曲中風味物質的形成及中溫大曲品質的改善具有不可忽視的作用。