浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯的變化規律研究

劉濤濤，蔡 凱，熊曉通，劉勝華，黃智安，王 喆*，肖 夢

（勁牌有限公司 勁牌研究院，湖北 黃石 435100）

中國是青梅的發源地，栽培歷史已有三千多年，青梅酒也成為我國最古老的果酒之一[1]。青梅酒具有清酸的獨特風味以及較高的保健功效和營養價值[2-3]，受眾廣泛。隨著人們健康意識的提高，飲酒安全越來越受到重視，青梅酒具有易污染氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）的特點[4]，這使其安全性受到了一定程度的質疑，不利于青梅產業的健康發展。EC天然產生于發酵食品和酒精飲料中，對人體具有潛在遺傳毒性和致癌性，于2007年被世衛組織列為2A類致癌物[5-8]。人類膳食攝入EC的主要來源是酒精飲料[9]，香港特區食物安全中心根據市民食物消費量調查結果進行風險評估后認為[10]：對于長期飲用大量酒精飲料的消費者，不能排除因攝入較高分量的EC而可能對健康構成風險。

我國青梅產量占世界總產量的70%[11]，由于鮮果酸度高，不適合鮮食，廣受歡迎的各類青梅加工品便應運而生，青梅酒便是其中之一。目前市售青梅酒有發酵型青梅酒、浸泡型青梅酒、發酵型勾兌浸泡型青梅酒[12]，相關研究主要針對青梅酒感官優化工藝技術，如口感優化、香氣優化、降酸、脫苦、澄清、護色、催陳等[12-14]，而對其安全研究主要在于EC污染監測、降低氰化物含量方法、EC檢測技術等[4，15-16]，少見對降低青梅酒EC含量的工藝方法研究。除了商業化青梅酒，青梅酒愛好者的家庭自制青梅酒在我國也很常見，浸泡工藝是其目前廣泛使用的生產方法[14]，但家庭自制時往往過于粗放，如不去核甚至有意劃破表皮、基酒酒精度高低不一、浸泡和陳放時間長、環境溫度波動大等，產生和過量攝入EC的潛在風險較高。因此，本實驗系統研究了多種因素對家庭自制浸泡型青梅酒中EC含量的影響規律，明確了有效減控EC含量的工藝參數，用以彌補家庭自制時缺乏針對安全性的工藝優化指導且難以進行安全指標監控的先天不足，為家庭自制青梅酒愛好者科學制作和安全飲用浸泡型青梅酒提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青梅鮮果（七至八成熟）：福建省詔安縣；96%vol伏特加（特級）：安徽安特食品股份有限公司；60%vol清香型、55%vol米香型、54%vol醬香型和66%vol濃香型白酒原酒（優級）：勁牌有限公司；冰糖（單晶）：廣東南字科技股份有限公司。

氨基甲酸乙酯標準品（99.50%）、氨基甲酸乙酯-d5標準品（純度＞98%）：德國DR EHRENSTORFER公司；甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純）：美國Sigma公司；氰化物（cyanide，CN）標準溶液（50 μg/L）：中國計量科學研究院；氫氧化鈉、酒石酸、磷酸二氫鉀、氯胺T、1,3-二甲基巴比妥酸、異煙酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

E2695-TQ Detector型液質聯用儀：美國Waters公司；Flex2型純水/超純水一體系統：威立雅水處理技術（上海）有限公司；AB135-S型分析天平：梅特勒托利多科技（中國）有限公司；FF-QHWL08型全自動酒類氰化物快速測定儀：北京吉天儀器有限公司；iCAP RQ型電感耦合等離子體質譜儀：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青梅酒制作工藝流程及操作要點

操作要點：

分選：挑選大小均勻（橫向直徑2.0～2.5 cm）、果肉硬實、色澤較青、表皮完好的新鮮青梅。

去蒂、清洗：用鑷子輕挑去蒂，避免破皮；清洗時同樣應避免破皮，且末道水使用純凈水，瀝干。

切削：分離果肉和果核。刀具和托盤用前洗凈。切削時應避免破壞果核外殼，允許果核外部殘留少許因黏連而分離困難的果肉。流出的且未被污染的汁液盡量回收并歸為果肉。

裝瓶：選擇密封良好的2.5 L規格玻璃瓶，洗凈、瀝干后分別裝入青梅果肉或果核或整果。

加冰糖：青梅裝瓶后盡快添加冰糖，在頂層青梅處一次性添加。

加漿降度：按目標酒精度在高度伏特加或白酒中添加相應量純凈水，混勻即為基酒。純凈水用量根據質量守恒原理計算。

加基酒：一次性添加所需基酒，密封后靜置3 d，此過程中冰糖將緩慢溶化，青梅將逐步上浮，以致部分未溶化的冰糖沉底，此時搖瓶助溶。若未加糖，亦在靜置3 d后進行同等程度的搖瓶。靜置15 d后搖瓶混勻一次，之后僅在取樣檢測前進行搖瓶混勻。

靜置：即陳化過程，陳化時避光，且儲存溫度需始終控制在≤25 ℃。

1.3.2 不同因素對酒中EC含量的影響

設置不同的工藝參數制作浸泡型青梅酒，考察不同因素對酒中EC含量的影響，具體參數設置見表1。

表1 浸泡型青梅酒制備參數Table 1 Preparation parameters of steeped type greengage wine

（1）原料對EC含量的影響

針對青梅果核、基酒酒精度、冰糖、基酒種類因素，設置實驗參數見表1的1#～18#，每組均設置3個平行樣。

（2）酒、果分離和加糖方式對EC含量的影響

以青梅整果為實驗樣品，設置3個平行樣，按表1的19#參數添加青梅和伏特加基酒，不加冰糖，密封；浸泡30 d后分離果渣與酒液；合并3個平行樣的酒液，混勻后均分為3份（即19#、20#、21#），其中第1份不加冰糖，第2份按對應青梅鮮果∶冰糖=1∶0.60的質量比添加冰糖并搖瓶溶糖，第3份與此前分離出的1/3青梅果渣混合且不加冰糖，每份設置3個平行樣。

（3）環境溫度對EC含量的影響

選取表1中已浸泡150 d的15#樣品為實驗對象，分離酒液和果渣，合并3個平行樣的酒液，混勻后分裝至125 mL規格玻璃瓶，密封；分別置于溫度為1 ℃、12 ℃、20 ℃、37 ℃、50 ℃的避光環境中存儲30 d，每個溫度條件下設置3個平行樣。

1.3.3 氨基甲酸乙酯檢測方法

參考熊曉通等[17]的方法，采用液質法對青梅酒中氨基甲酸乙酯含量進行測定。

樣品前處理：準確吸取樣品0.95 mL于1.5 mL離心管中，加50 μL氨基甲酸乙酯-d5內標使用液，渦旋混勻，置于80～90 ℃烘箱中脫乙醇，待離心管中液面揮至0.4～0.5 mL時取出，冷卻；使用虹吸管加水定容至1 mL，混勻，經0.45 μm水系過濾膜過濾后，待上機檢測EC含量。

液相色譜條件：Xselect HSS T3色譜柱（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；洗脫方式為梯度洗脫，流速0.3 mL/min，具體程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure

質譜條件：電噴霧離子源（electron sprayionization，ESI）；掃描模式為正離子模式；霧化器溫度400 ℃；離子源溫度150 ℃；霧化氣流速800 L/h；毛細管電壓3 kV；錐孔氣體流速100 L/h；碰撞氣流速0.17 mL/min。多反應監測采集條件見表3。

表3 多反應監測采集條件Table 3 Acquisition conditions for multiple reaction monitoring

1.3.4 氰化物含量測定

采用流動注射檢測方法，取50 μL試樣于5 mL容量瓶中，用氫氧化鈉溶液（1.0 g/L）定容至刻度混勻，將樣品溶液倒入進樣管中，放到自動進樣器上進樣，測定氰化物含量。

蠕動泵梯度設置：泵速20 r/min；到達閥時間300 s；注射時間80 s；樣品周期220 s；進樣時間140 s；清洗時間30 s；進樣針清洗時間10 s；加熱模塊1溫度118 ℃；加熱模塊2溫度85 ℃；前端采集增益100 K。

1.3.5 酒精度和銅含量檢測

酒精度采用GB 5009.225—2023《食品安全國家標準酒和食用酒精中乙醇濃度的測定》中第二法測定；銅含量采用GB 5009.13—2017《食品安全國家標準食品中銅的測定》中第三法測定。

1.3.6 數據分析

采用Excel 2016軟件進行數據統計、圖表制作，采用Origin 9.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 果核對浸泡型青梅酒中EC的影響

由圖1a可知，果核酒和整果酒中EC含量均隨著浸泡時間的增加而持續極顯著地增加（P＜0.01），果肉酒中則先增后減，且三者在≥30 d后的相同時間點的差異均極顯著（P＜0.01）：果肉酒中EC增速極其緩慢（≤7.58 μg/L）且遠低于果核部位的3 033.89 μg/L，整果酒的EC含量309.96 μg/L則介于果核酒和果肉酒之間。表明浸泡型青梅酒中的EC主要源于青梅果核，且果核的暴露程度越小越有利于減緩EC的增長。

圖1 果核對浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯（a）及氰化物（b）含量的影響Fig.1 Effect of kernels on ethyl carbamate (a) and cyanide (b)contents in steeped greengage wine

青梅果核中含有苦杏仁甙，苦杏仁甙在酸性條件下易水解為氫氰酸[18]，而氰化物是酒精飲料中EC的主要前體物質之一[7，19-20]。由圖1b可知，果核酒中氰化物含量高且增速快，30 d即達峰值17 968.60 μg/L，而果肉酒中則含量極低（≤29.55 μg/L）且未持續增長，二者在不同時間點相差約534～1 583倍，這與EC在果核酒、果肉酒中的含量高低表現一致。文獻亦報道通過去果核的方式減少果酒中氰化物的含量，可控制EC的形成[21]，與實驗結論一致。

2.2 基酒酒精度對浸泡型青梅酒中EC的影響

由圖2可知，各酒樣中EC含量總體上隨著基酒酒精度的提高而極顯著地升高（P＜0.01，僅在60%vol且90 d時P＜0.05），亦隨著浸泡時間的延長而極顯著地升高（P＜0.01）；其中，浸泡150 d后，基酒酒精度為60%vol時酒樣的酒精度為29.9%vol，EC含量高達964.39 μg/L，約是20%vol基酒時（酒樣酒精度為10.2%vol）的4.2倍，約是其自身在浸泡30 d時的4.7倍。這是由于EC是由其前體物質與乙醇反應生成[22]，更高的乙醇含量可提高反應物分子在單位時間內的碰撞幾率，更容易發生轉化反應，符合化學反應碰撞理論[23]，因此降低體系酒精度可顯著降低浸泡型青梅酒中的EC累積。

圖2 基酒酒精度對浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.2 Effect of alcohol content of base liquor on ethyl carbamate contents in steeped greengage wine

2.3 冰糖用量對浸泡型青梅酒中EC的影響

由圖3可知，當青梅與冰糖比例從1∶0上升至1∶0.15時，各酒樣中EC含量均有增長且≥90 d時增幅顯著，150 d時達到368.55 μg/L，這是由于冰糖溶解后提高了溶液的滲透壓，高滲環境促使果核中EC前體物質加速滲出，繼而轉化出更多的EC。繼續提高冰糖比例，EC含量總體呈顯著或極顯著下降趨勢（P＜0.05或P＜0.01），但這種下降是冰糖用量不斷增大引起體積增大后EC被稀釋所導致。此外，青梅酸度極高，浸泡型青梅酒需要輔以較多的冰糖才具適口性，綜合考量青梅與冰糖的比例介于1∶0.45～1∶0.60為宜。

圖3 冰糖用量對浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.3 Effect of crystal sugar addition on ethyl carbamate contents in steeped greengage wine

2.4 基酒種類對浸泡型青梅酒中EC的影響

由圖4可知，伏特加、清香型白酒、米香型白酒、醬香型白酒、濃香型白酒作為基酒的青梅酒中EC含量均隨著儲存時間的延長而極顯著地增長（P＜0.01）。浸泡150 d后的EC凈增量分別為368.55 μg/L、244.32 μg/L、243.05 μg/L、233.71 μg/L、236.32 μg/L，其中清香型、米香型、醬香型和濃香型白酒作為基酒的酒樣中EC凈增量相近，差異不顯著（P＞0.05）；伏特加基酒中雖未檢出EC，但對應酒樣中的EC凈增量卻明顯高于白酒基酒，對比差異極顯著（P＜0.01），可能是因為白酒中某些微量成分具有一定的減緩浸泡型青梅酒中EC轉化速率的作用，相關機理有待進一步研究。此外，濃香型白酒、醬香型白酒酒香濃郁，與青梅酒清爽的香氣調性匹配度弱于清香型白酒、米香型白酒。綜合考慮，浸泡型青梅酒基酒選擇優質清香型或米香型白酒為宜。

圖4 不同基酒種類對浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.4 Effect of different types of base liquor on ethyl carbamate contents in steeped greengage wine

2.5 酒、果分離和加糖方式對浸泡型青梅酒中EC的影響

由圖5可知，酒、果分離后，EC含量雖仍隨著浸泡時間的延長而增長，但明顯慢于不分離的酒樣，且是否添加冰糖對EC含量的增速差異在180 d時極顯著（P＜0.01），分離后添加冰糖條件下，180 d時的EC含量（247.61 μg/L）高達酒、果分離初始時（59.67 μg/L）的4.2倍，分離后不添加冰糖條件下則僅約2.1倍；4種酒樣的EC含量在180 d時兩兩之間差異均顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）。不分離且不加糖酒樣的EC含量在≤150 d時高于或接近不分離且0 d時就加糖酒樣，這是由于本組實驗青梅與冰糖的比例為1∶0.6，加糖與否的體積相差較大所導致。總之，冰糖對浸泡型青梅酒中EC累積起到的作用不限于前述的促進EC前體物質滲出，還疊加促進了前體物質向EC的轉化，對冰糖與伏特加的銅含量進行測定，結果表明冰糖的含銅量（0.019 2 mg/kg）遠高于伏特加基酒（未檢出），且銅離子是氰酸鹽向EC轉化的重要催化劑[22]。因此及時進行酒、果分離以及推遲冰糖添加時間點對減緩EC增速均有積極作用。

圖5 酒、果分離和加糖方式對浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.5 Effect of separation of wine and fruit and method of adding sugar on ethyl carbamate contents in steeped greengage wine

2.6 溫度對浸泡型青梅酒中EC的影響

由圖6可知，與初始值相比，EC含量隨著存儲溫度的上升而非勻速增長，且在≤12 ℃的低溫條件下增速緩慢，差異不顯著（P＞0.05）；20～37 ℃時增速明顯加快，差異極顯著（P＜0.01）；50 ℃的高溫條件下增速更快，差異極顯著（P＜0.01）。這與黃酒[24]、白酒[25]、葡萄酒[26]、發酵型青梅酒[27]等酒精飲料體系中溫度對EC轉化的正相關影響規律一致。因此，降低環境溫度至20 ℃以下可有效減緩浸泡型青梅酒中EC的累積。

圖6 存儲溫度對浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.6 Effect of storage temperature on ethyl carbamate contents in steeped greengage wine

此外，綜合前文實驗現象可發現，非冷藏條件下，EC的上升趨勢在實驗周期內均未見終止，說明在前體物質轉化完畢或達到某種平衡前，EC的上升可能會持續較長時間，因此即使采取了各種工藝優化措施，亦不宜在常溫條件下長時間陳放不去核工藝的浸泡型青梅酒。

2.7 家庭自制浸泡型青梅酒EC污染風險評估及防控建議

2.7.1 EC污染風險評估

我國尚未制定飲料酒的EC限量標準，參考韓國對青梅酒400 μg/L的EC限量標準[4]進行污染風險評估。由圖1～圖6可知，1#去核酒樣的EC超標風險極小，可忽略不計；其他工藝條件的酒樣隨著時間的延長，均存在EC超標風險或趨勢。其中，19#和20#酒樣，由于適時進行了酒、果分離，阻斷了果核持續釋放EC前體物質的源頭，實驗周期內EC雖仍呈上升趨勢，但速度相對最慢且未超標；酒精度的負面影響最明顯，當基酒酒精度≥40%vol時，EC累積速度明顯快于基酒酒精度≤30%vol酒樣，前者在90～150 d內超標；若加嚴參考加拿大等國對蒸餾酒150 μg/L的EC限量標準[28-29]，除了1#去核酒樣，其他酒樣在浸泡30～150 d內均超標。

2.7.2 EC污染防控建議

相較于商業化青梅酒，家庭自制浸泡型青梅酒更易發生EC偏高問題，與實際調查結果一致[16]。為控制EC生成和減少攝入量，2種浸泡型青梅酒家庭自制工藝和飲用方法推薦見表4，可為自制浸泡型青梅酒提供參考。

表4 浸泡型青梅酒家庭自制工藝和飲用方法推薦Table 4 Suggestions on the process and drinking methods of homemade steeped greengage wine

3 結論

本研究探討了不同因素作用下浸泡型青梅酒中EC的變化規律，發現浸泡型青梅酒易污染EC且增速較快，其前體物質主要來源于果核。果核暴露程度、酒精度、冰糖添加方式、浸泡及陳放時間、環境溫度均是影響EC累積的顯著因素；清香型、米香型、醬香型和濃香型白酒作為基酒時的EC新增污染程度相差無幾，但極顯著低于伏特加基酒（P＜0.01）。可見，以當前主流家庭自制工藝制作的浸泡型青梅酒具有應當引起人們重視的食品安全風險，去核工藝可一勞永逸的消除該風險，否則應降低基酒酒精度、推遲加糖時間點、減少浸泡和陳放時間、降低存儲溫度，以達到降低EC含量的目的。