一測多評法同時測定連翹葉紅茶中5種指標成分的含量

楊瑩瑩

（山西省藥品審評中心（山西省醫藥與生命科學研究院），山西 太原 030006）

連翹葉為木犀科植物連翹（Forsythia suspense（Thunb.）Vahl）的干燥葉，具有清熱解毒之功效[1]。我國連翹葉資源豐富，在我國河北、山西、河南等地連翹葉歷來有作為保健茶飲用的傳統，具有良好的開發前景。現代藥理學研究表明，連翹葉具有抑菌[2-3]、抗氧化[4-6]、抗腫瘤[7]、護肝[8]、降血脂[9]、降血糖[10]等多種生物活性，含有木質素類、黃酮、三萜類等活性成分，其中連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁、連翹脂素和槲皮素含量較高[11]。同時還富含蛋白質、氨基酸、膳食纖維、維生素及礦物質等多種營養成分[12-13]。

2018年連翹葉被批準作為山西省特色地方食品管理，為連翹葉作為食品開發奠定了基礎。因此，近年來連翹葉茶成為眾多研究學者的研究對象。原江鋒等[14]將一芽二葉至一芽三葉的連翹嫩葉加工成連翹葉綠茶，并對連翹葉綠茶的活性成分進行分析，結果表明，連翹葉綠茶具有較強的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力。尤穎[15]以陰干的連翹葉、炒制殺青的連翹葉和殺青發酵的連翹葉作為原料，制備出三種連翹葉速溶茶，通過單因素和響應面試驗優化了連翹葉速溶茶水提工藝。結果表明，殺青發酵的連翹葉制備速溶茶的感官評價得分最高。楊麗霞等[16-17]以連翹葉為主要原料，研制了連翹葉綠茶和連翹葉復合袋泡茶兩種產品。

目前，關于連翹葉茶的質量控制研究相對較少，且多以1種或2種指標成分進行含量測定[18-19]，無法客觀反映產品的內在質量。在對照品難以獲得、價格昂貴的前提下，多指標含量質量控制模式的發展在一定程度上受到了限制。本研究以連翹葉紅茶為研究對象，建立一測多評法[20-23]（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）測定連翹葉紅茶中的蘆丁、連翹酯苷A、槲皮素、連翹苷和連翹脂素5種指標成分含量，并進行方法學考察。采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，以連翹苷作為內參物，建立其與蘆丁、連翹酯苷A、槲皮素和連翹脂素的相對校正因子。利用一測多評法（QAMS）和外標法（external standard method，ESM）同時測定5種指標成分含量，并比較這2種方法檢測結果的差異，探索QAMS法在連翹葉紅茶質量評價中的可行性，為連翹葉紅茶的多指標質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 材料

連翹葉紅茶樣品（產地為山西省長治市）：由山西盤秀山農業科技開發有限公司提供。樣品共10批，批號分別為①20200412、②20200413、③20200415、④20210411、⑤20210413、⑥20210416、⑦20220413、⑧20220415、⑨20220418、⑩20220420。

1.1.2 化學試劑

蘆丁對照品、槲皮素對照品、連翹苷對照品（純度均≥98%）：中國食品藥品檢定研究院；連翹酯苷A對照品（純度≥98%）、連翹脂素對照品（純度≥98%）：成都麥德生科技有限公司。乙腈（色譜純）：德國CNW科技公司；甲醇、乙醇、磷酸（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；水為實驗室自制超純水。

1.2 儀器與設備

LC-2010A型高效液相色譜（HPLC）儀：日本島津公司；1260型高效液相色譜儀、ZORBAX SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：美國安捷倫公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；AR124CN型分析天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；Thermoscientific HyPURITY C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國Thermo Scientific公司；Athena C18-WP色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：上海安譜實驗科技股份有限公司；UPHW-I-90T型優普系列超純水系統：成都超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁、連翹苷、槲皮素、連翹酯苷A和連翹脂素對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度分別為蘆丁101 μg/mL、連翹苷402 μg/mL、槲皮素102 μg/mL、連翹酯苷A 403 μg/mL和連翹脂素99 μg/mL的混合對照品溶液，備用。

1.3.2 樣品溶液的制備

本研究結合連翹葉茶的日常飲用習慣，采用水為溶劑，以加熱回流的方式進行提取。提取條件考察了提取時間、提取溫度和提取次數。由于本方法為檢測方法，樣品制備方法要求操作簡便、重復性好、穩定可靠，因此綜合考慮方法的可操作性、系統誤差、時間成本等多種因素，最終確定提取時間為1 h、提取溫度為95 ℃、提取次數為1次。

精密稱取連翹葉紅茶粉末5.0 g，置于200 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水，95 ℃恒溫水浴加熱回流1h，取出放涼，稱定質量，用蒸餾水補足質量損失，過濾，得連翹葉紅茶提取液。精密量取上述提取液1 mL置于10 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，過0.22 μm的微孔濾膜，得到樣品溶液，備用。

1.3.3 高效液相色譜條件

Thermoscientific HyPURITY C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫：0～20 min，A相為10%～25%；20～30 min，A相為25%～40%；30～35 min，A相為40%～60%；35～36 min，A相為60%～10%；36～40 min，A相為10%～10%。檢測波長277 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。

1.3.4 相對校正因子的計算

以連翹苷為內參物，相對校正因子計算公式如下[24]：

式中：fs/i為內參物與其他組分之間的相對校正因子；As為內參物的峰面積；Cs為內參物的質量濃度，μg/mL；Ai為其他組分的峰面積；Ci為其他組分的質量濃度，μg/mL。

1.3.5 樣品的測定

精密稱取10批連翹葉紅茶樣品粉末各5.0 g，按照“1.3.2”項下方法制備樣品溶液，各平行制備3份，按照“1.3.3”項下色譜條件進行HPLC分析，采用外標法和一測多評法分別計算5種指標成分的含量。

1.3.6 數據處理

采用Excel 2019和SPSS25.0軟件對2種方法檢測數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 混合對照品及樣品中5種指標成分高效液相色譜法測定結果

混合對照品及樣品中5種指標成分高效液相色譜法測定結果見圖1。由圖1可知，5種指標成分的色譜峰分離情況良好。

圖1 混合標準品（A）及樣品（B）中5種指標成分高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of 5 indexes components in mixed standards (A) and samples (B)

2.2 色譜條件優化

2.2.1 流動相的選擇

本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液等不同流動相體系的色譜峰分離情況，結果表明，乙腈-0.1%磷酸溶液體系各色譜峰峰型良好、基線平穩。因此，確定最適流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫。

2.2.2 檢測波長的選擇

對5種指標成分進行了全波長掃描，根據掃描結果選擇各指標成分的最大吸收波長為檢測波長。本研究分別考察了254 nm、277 nm、330 nm和365 nm檢測波長下的色譜出峰情況。結果顯示，5種指標成分在波長277 nm條件下均有較強的紫外吸收。因此，選擇檢測波長為277 nm。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線線性回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限及定量限

取混合對照品溶液適量，稀釋成6個不同質量濃度水平的混合對照品溶液，分別置于進樣瓶中，按照“1.3.3”項下色譜條件下進樣檢測，記錄峰面積，以質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程、相關系數及線性范圍。5種指標成分以信噪比（S/N）=3時的質量濃度為檢測限，S/N=10時的質量濃度為定量限，結果見表1。

表1 5種指標成分的標準曲線回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限及定量限Table 1 Standard curve regression equations, correlation coefficients, linear range, detection limit and quantitative limit of 5 kinds of index components

由表1可知，5種指標成分的質量濃度和峰面積在各自范圍內線性關系良好（相關系數R2均＞0.999），其檢出限范圍為0.45～0.78 μg/mL，定量限范圍為1.49～2.59 μg/mL。結果表明，檢出限和定量限均能滿足5種指標成分的檢測分析要求。

2.3.2 精密度試驗

取同一批次連翹葉紅茶粉末（批號：20220418）5份，按照“1.3.2”項下方法制備樣品溶液進樣測定，記錄峰面積，計算精密度試驗結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。結果表明，蘆丁、連翹酯苷A、槲皮素、連翹苷和連翹脂素測定結果的RSD分別為2.24%、1.50%、2.06%、1.43%、2.39%，RSD均＜3.0%。結果表明，該方法的精密度良好。

2.3.3 加樣回收率試驗

稱取已知5種指標成分含量的連翹葉紅茶樣品（批號：20220418）約0.10 g，平行制備5份，分別加入適量混合對照品溶液，按“1.3.2”項下方法制備樣品溶液進樣測定，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 5種指標成分的加標回收率試驗結果（n=5）Table 2 Results of standard recovery rate tests of 5 kinds of index components (n=5)

由表2可知，各成分加樣回收率為95.19%～101.77%，平均加樣回收率為98.25%～99.63%，RSD為1.34%～2.54%，RSD均＜3.0%。結果表明，該方法準確度良好。

2.3.4 穩定性試驗

取同一樣品溶液（批號：20220418），樣品制備后分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣測定，記錄峰面積，計算RSD。結果表明，蘆丁、連翹酯苷A、槲皮素、連翹苷和連翹脂素檢測結果的RSD分別為2.05%、2.16%、2.53%、1.46%、2.44%，RSD均＜3.0%。結果表明，該方法穩定性良好。

2.4 相對校正因子的建立

2.4.1 相對校正因子的計算

以連翹苷作為內參物，根據公式分別計算連翹苷對蘆丁、槲皮素、連翹酯苷A和連翹脂素4種指標成分的相對校正因子，結果見表3。

表3 4種指標成分對連翹苷的相對校正因子Table 3 Relative correction factors of 4 kinds of index components to forsythin

由表3可知，各校正因子的RSD均＜2.0%。綜合比較影響校正因子的各個因素，最終確定取各校正因子的均值，即連翹苷對蘆丁、槲皮素、連翹酯苷A和連翹脂素的校正因子分別為1.091 4、1.257 5、1.019 1、1.373 7。

2.4.2 校正因子的耐用性考察

校正因子的耐用性可通過改變不同的色譜參數來考察各因素對校正因子的影響。通常用不同條件下各指標成分校正因子之間的RSD表示。柱溫、流速、檢測波長等條件的微小變化一般對耐用性影響較小，而不同品牌色譜柱和不同型號高效液相色譜儀對其影響較大，因此本研究選擇3種不同色譜柱和2種不同儀器進行校正因子的耐用性考察。

取混合對照品溶液適量，精密吸取10 μL進樣測定，分別考察了HyPURITY C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Athena C18-WP色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）3種不同色譜柱、島津LC-2010A型液相色譜儀和安捷倫1260型液相色譜儀等2種色譜儀的耐用性，結果見表4。

表4 不同色譜柱和不同儀器條件下4種指標成分對連翹苷的相對校正因子比較Table 4 Comparison of relative correction factors of 4 kinds of index components to forsythin under different chromatographic columns and instruments conditions

由表4可知，4個指標成分對連翹苷的相對校正因子變化較小，RSD均＜3.0%，表明不同色譜柱和不同儀器的耐用性良好。

2.5 一測多評法與外標法檢測結果比較

取10批連翹葉紅茶樣品，按“1.3.2”項下方法制備樣品溶液，分別吸取10 μL進樣測定。利用一測多評法和外標法分別計算連翹葉紅茶中蘆丁、連翹酯苷A、槲皮素、連翹苷和連翹脂素的含量，結果見表5。由表5可知，2種方法測得含量結果均無顯著性差異（P＞0.05），表明QAMS法準確度良好，可用于連翹葉紅茶的多指標成分檢測。

表5 一測多評法和外標法5種指標成分含量測定結果比較（n=3）Table 5 Comparison of determination results of 5 kinds of index components contents by quantitative analysis of multicomponents by single marker and external standard method (n=3)

3 結論

本研究以連翹葉紅茶為研究對象，采用高效液相色譜法，以連翹苷為內參物，計算其與蘆丁、連翹酯苷A、槲皮素和連翹脂素的相對校正因子，建立一測多評法計算各指標成分的含量，并與外標法的結果進行比較。結果表明，5種指標成分的質量濃度和峰面積在各自范圍內線性關系良好，相關系數R2均＞0.999，其檢出限范圍為0.45～0.78 μg/mL，定量限范圍為1.49～2.59μg/mL，平均加標回收率在98.25%～99.63%，加標回收率、精密度、穩定性試驗結果RSD均＜3.0%，表明QAMS法精密度、準確度、穩定性良好。一測多評法（QAMS）和外標法（ESM）測定10批連翹葉紅茶中5種指標成分含量結果之間無顯著差異（P＞0.05），表明一測多評法用于連翹葉紅茶的多指標質量控制具有良好的可行性，可為連翹葉紅茶的質量控制提供參考。