鹽酸羥哌吡酮對脂多糖誘導小鼠抑郁樣和焦慮樣行為的改善作用及對BV2細胞抗炎作用相關機制

常海霞，崔林雨，李云峰2，，代 威，張繼國

〔1.山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）藥學院，山東 泰安 271016；軍事科學院軍事醫學研究院 2.軍事認知與腦科學研究所，3.毒物藥物研究所，北京100850〕

抑郁癥作為一種情感障礙性疾病，以持久反復的心境低落為主要特征，已成為嚴重的全球性公共衛生難題和社會問題。我國抑郁癥患病率也呈現逐年上升趨勢，到2023 年已達到約4.2%［1］。目前臨床一線的抗抑郁藥大多基于“單胺假說”研發，其中代表性藥物包括選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑（如氟西汀和舍曲林）等［2］。這些單胺能藥物在治療抑郁癥的同時也存在有效率不高（50%～70%）、起效延遲（4～6 周）、導致性功能障礙和自殺傾向等缺陷［2］。明確抑郁癥發病機制，發展更為快速、有效且不良反應低的抗抑郁藥迫在眉睫。

鹽酸羥哌吡酮（YL-0919）是軍事醫學研究院毒物藥物研究所研發的全新結構抗抑郁小分子化合物，目前作為1.1 類新藥處于Ⅱ期臨床試驗階段。前期研究表明，YL-0919 在多種動物模型中發揮顯著抗抑郁和抗焦慮作用，且具有快速起效（3～7 d）、增強認知功能和不導致性功能障礙等優點［3］。最近研究發現，YL-0919 具有選擇性激動Sigma-1 受體（Sigma-1 receptor，Sig-1R）的作用［4］，但YL-0919是否通過調節炎癥反應發揮抗抑郁效應及Sig-1R在其中的作用仍未可知。

文獻報道，抑郁癥的發生可能與炎癥反應和免疫激活密切相關［5］。臨床研究結果提示，抑郁癥患者血清與腦脊液中多種促炎細胞因子〔如白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、γ 干擾素和腫瘤壞死因子α 等〕含量顯著增加［6-7］。在動物水平，注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）能夠快速誘導其體內炎癥反應，可導致抑郁樣行為［8］。小膠質細胞是中樞神經系統固有免疫細胞，作為腦內神經炎癥的主要調節者，在神經發育和中樞穩態調節等方面具有重要作用［9］。小膠質細胞過度活化會釋放大量促炎因子［10-11］。基于此，有學者提出抑郁癥的“炎癥損傷假說”，認為應激等因素通過引發中樞神經系統小膠質細胞活化和機體免疫調節紊亂而導致的炎癥損傷是抑郁癥發生的重要原因之一［12］。

LPS 誘發神經炎癥反應可能與Sig-1R 功能變化相關［13］。Sig-1R 作為受體型分子伴侶，能夠調節神經炎癥和突觸發生，可能是治療多種神經精神類疾病和神經退行性疾病的潛在靶點［14］。Sig-1R 被激活后從內質網-線粒體界面解離，與膜蛋白或血漿蛋白結合，發揮多種生物活性［15］。Sig-1R 激動劑可減輕線粒體損傷，調節線粒體呼吸功能障礙，并減少活性氧和細胞凋亡的異常增加［16］。在動物實驗中，Sig-1R敲除的雄性小鼠在強迫游泳實驗和懸尾實驗中表現出不動時間延長等行為［17］。沉默Sig-1R功能可導致原代海馬神經元樹突棘密度降低和新生神經元數量減少［18］。小膠質細胞上也分布著較豐富的Sig-1R，文獻報道，Sig-1R 激活可影響小膠質細胞功能［13］。

本研究通過ip 給予LPS 誘導小鼠抑郁樣行為模型，評價YL-0919 的抗抑郁和抗焦慮效應，探究該效應與炎癥反應和炎癥因子的相關性，在細胞水平通過建立LPS炎癥模型，探究YL-0919對小膠質細胞系BV2細胞炎癥反應的調節作用，并采用Sig-1R拮抗劑進一步驗證該受體在YL-0919 抗抑郁作用中的功能。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

YL-0919（批號：D5222-18-001，純度99.9%），由軍事醫學研究院毒物藥物研究所提供；LPS（批號：L2880，純度＞98%），美國Sigma 公司；Sig-1R拮抗劑BD1047（貨號：HY-16996A）和NE-100（貨號：HY-101484A），美國MCE公司。兔抗小鼠NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3，貨號：ab263899）和IL-1β（貨號：ab234437）單克隆抗體，英國Abcam 公司；兔抗小鼠β-肌動蛋白單克隆抗體（貨號：CW0096M），江蘇康為世紀生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 抗體（二抗），北京中杉金橋公司；DMEM 高糖培養基和胎牛血清，美國Gibco公司；Trizol，上海碧云天生物技術有限公司；無RNA 酶水和逆轉錄試劑盒（R333-01），南京諾唯贊生物科技有限公司。PCR儀（TC-EA-48DA），美國Bio-Rad 公司；熒光定量PCR 儀（QuantStudio3），德國Angilent Technologies 公司；細胞培養箱，美國Thermo Scientific 公司；小鼠曠場和強迫游泳實驗裝置，深圳瑞沃德生命科技有限公司；SMART Video-Tracking System V3.0 軟件，西班牙Panlab 公司；凝膠電泳相關器材，美國伯樂公司；Odyssey 雙色紅外熒光成像系統（OSA-0358），美國LI-COR 公司；多功能酶標儀（EnVisionTM 2104），美國PerkinElmer公司。

1.2 LPS誘導模型小鼠實驗

1.2.1 實驗動物

40 只10 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，SPF 級，初始體重24～25 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。所有動物購入后在標準化環境條件下適應7 d 后進行實驗。飼養環境溫度20～24 ℃，濕度40%～60%，12 h 黑暗/白晝交替照明（光照時間為8∶00-20∶00），小鼠自由進食飲水。所有動物實驗程序均經軍事醫學研究院實驗動物福利倫理委員會批準。

1.2.2 實驗分組和藥物處理

小鼠隨機分為正常對照組、模型組、模型+YL-0919組和模型+YL-0919+BD1047組，每組10只。模型組在實驗第1 天和第6 天分別ip 給予LPS 0.5 mg·kg-1；模型+YL-0919組除以同樣方法給予LPS外，在第2～6天每日2次ig給予YL-0919 2.5 mg·kg-1；正常對照組不給LPS，每日2次ig給予生理鹽水；模型+YL-0919+BD1047 組在以同樣方法給予LPS和YL-0919 的同時，在第2～6 天每日1 次ip 給予Sig-1R 拮抗劑BD1047 4 mg·kg-1。第7 天進行小鼠開場實驗和強迫游泳實驗檢測。

1.2.3 開場實驗（open field test，OFT）［19］

小鼠開場箱（41 cm×41 cm×41 cm）材質為灰色不透明不反光防滑有機玻璃，底部劃分為16個大小相等的小方格。實驗開始前將小鼠放置在實驗房間適應至少1 h。實驗時將小鼠面向箱壁放入實驗箱，自由活動5 min 并錄像。采用SMART 視頻分析軟件分析小鼠自發活動，記錄小鼠運動總距離、進入中央區累計停留時間和進入次數。

1.2.4 小鼠強迫游泳實驗（forced swimming test，FST）［20］

小鼠強迫游泳缸（底部直徑12 cm，高20 cm）材質為透明玻璃，水深為16 cm，水溫為（23±1）℃，各游泳缸之間用黑色擋板隔開，以免小鼠之間相互影響。實驗前將小鼠放置在實驗房間適應至少1 h。實驗時，將小鼠放入游泳缸后錄制小鼠行為6 min，統計后4 min 小鼠的不動時間。當小鼠直立漂浮或僅做很小的動作來保持頭部平衡時，認為其處于不動狀態。

1.2.5 Western印跡法檢測小鼠前額葉皮質NLRP3和lL-1β蛋白表達水平

行為學檢測后將小鼠處死，取腦并分離前額葉皮質，-80 ℃保存。前額葉皮質組織超聲研磨2～3 次，4 ℃靜置30 min 后，12 000×g離心10 min，取上清。采用BCA 法對組織蛋白進行定量，將含有30 μg 蛋白的樣品通過電泳分離，轉移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉。分別加入抗NLRP3、IL-1β 和β-肌動蛋白抗體（1∶1000）4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜5 min，共3 次。加入二抗（1∶5000）室溫下避光孵育2 h。使用Odyssey雙色紅外熒光成像儀顯影，用Image J 軟件分析蛋白條帶積分吸光度值。以β-肌動蛋白作為內參，以目標蛋白與內參蛋白積分吸光度值的比值反映目標蛋白相對表達水平。

1.3 LPS誘導模型BV2細胞實驗

1.3.1 細胞和細胞培養

BV2 細胞購于北京協和醫學院細胞資源中心。用完全培養基（90% DMEM+10%胎牛血清）培養于37 ℃、5% CO2培養箱中，待細胞生長密度達到約80%時傳代。取對數生長期細胞進行實驗。

1.3.2 RT-qPCR 法檢測細胞炎癥因子IL-6 和IL-1β mRNA表達水平

將BV2 細胞接種到12 孔板中，每孔1×105細胞。將細胞分為細胞對照組（DMEM 培養6 h）、LPS組（LPS 1 mg·L-1，孵育6 h）、LPS+YL-0919組（YL-0919 2 μmol·L-1孵育1 h 后用PBS 清洗，再加LPS 1 mg·L-1孵育6 h）和LPS+YL-0919+NE-100組（YL-0919 2 μmol·L-1和NE-100 10 μmol·L-1共同孵育1 h 后用PBS 清洗，再加LPS 1 mg·L-1孵育6 h），每組3 復孔。吸棄培養基，PBS 清洗后加入500 μL Trizol冰上裂解10 min；加入100 μL氯仿，混勻后冰上靜置至分層，離心15 min（4 ℃，12 000×g）。取200 μL上清加入等體積異丙醇，混勻后冰上靜置10 min，4 ℃，12 000×g離心15 min，棄上清，加70%乙醇重懸沉淀，再次于4 ℃，12 000×g離心5 min；棄上清后加適量無RNA 酶水溶解RNA。檢測RNA濃度后，取1 μg RNA作為模板，逆轉錄合成cDNA。逆轉錄程序：55 ℃孵育5 min，85 ℃加熱5 s，4 ℃冷卻。將所得cDNA作為模板進行RT-qPCR擴增。反應體系：模板1～2 μL cDNA，2×SYBR Mix，正、反向引物各1 μL，補充無RNA 酶水至20 μL。RT-qPCR程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，變性退火延伸40個循環，獲得各樣品的熔解曲線。以β-肌動蛋白作為內參，以2-△△CT法計算目的基因mRNA 相對表達水平。引物序列見表1，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

Tab.1 Real time-quantitative PCR（RT-qPCR）primer sequence

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 YL-0919 對LPS 誘導小鼠抑郁樣和焦慮樣行為的影響

實驗結果（圖1）顯示，在OFT中，與正常對照組相比，各處理組小鼠總運動距離均無顯著性差異，提示各藥物處理組不影響小鼠的中樞興奮性。與正常對照組相比，模型組小鼠OFT 中央區停留時間顯著縮短（P＜0.05）和進入中央區次數顯著減少（P＜0.01），游泳不動時間顯著延長（P＜0.01），提示LPS可誘導小鼠產生焦慮樣和抑郁樣行為。與模型組相比，模型+YL-0919 組OFT 中央區停留時間顯著延長（P＜0.01），進入中央區次數顯著增加（P＜0.05），游泳不動時間顯著縮短（P＜0.01）。與模型+YL-0919 組比較，模型+YL-0919+BD1047 組OFT中央區停留時間顯著縮短（P＜0.01）和中央區進入次數顯著減少（P＜0.05），游泳不動時間顯著延長（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of hypidone hydrochloride（YL-0919）on total distance（A），time in center（B）and entries into center（C）in open field test（OFT）and immobility time（D）in forced swimming test（FST）in lipopolysaccharide（LPS）-induced model mice. Mice were divided into normal control，model，model+YL0919 and model+YL0919+BD1047 groups. On the first and sixth days of the experiment，mice were given LPS（0.5 mg·kg-1，ip）. From the second to the sixth days of the experiment，YL-0919（2.5 mg·kg-1，twice a day，ig）was administered alone or co-administered with BD1047（4 mg·kg-1，once per day，ip）. ±s，n=9-10. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with model+YL-0919 group.

2.2 YL-0919 對LPS 誘導小鼠前額葉皮質炎癥小體NLRP3和炎癥因子lL-1β蛋白表達水平的影響

實驗結果（圖2）顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠前額葉皮質IL-1β 和NLRP3 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，模型+YL-0919 組IL-1β 和NLRP3 蛋白水平顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；與模型+YL-0919 組比較，模型+YL-0919+BD1047 組IL-1β 和NLRP3 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。

Fig.2 Effect of YL-0919 on protein levels of lL-1β（A）and inflammasome NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3（NLRP3，B）in prefrontal cortex of LPS-treated mice by Western blotting. See Fig.1 for the mouse treatment. B was the semi-quantitative result of A.±s，n=4. ＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△P＜0.05，compared with model+YL-0919 group.

2.3 YL-0919 對LPS 誘導BV2 細胞IL-1β 和IL-6 mRNA表達水平的影響

RT-qPCR 結果（圖3）顯示，與細胞對照組相比，模型組BV2 細胞炎癥因子IL-6和IL-1βmRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+YL-0919 組BV2細胞IL-6和IL-1βmRNA 表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型+YL-0919 組比較，模型+YL-0919+ NE-100 組BV2 細 胞IL-6和IL-1βmRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of YL-0919 on mRNA levels of IL-1β and IL-6 in LPS-treated BV2 cells by RT-qPCR. See Fig.1 for the mouse treatment. ±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with model group；△P＜0.05，compared with model+YL-0919 group.

3 討論

本研究結果顯示，YL-0919（2.5 mg·kg-1）給藥5 d可明顯改善LPS 模型小鼠抑郁樣、焦慮樣行為，抑制LPS 誘導的小鼠前額葉皮質NLRP3 和IL-1β蛋白表達水平的增加；同時，YL-0919（2 μmol·L-1）能逆轉LPS 誘導的BV2 細胞IL-1β和IL-6mRNA表達水平升高；以上效應被BD1047 和NE-100 所逆轉。提示YL-0919 可能通過作用于Sig-1R 改善神經炎癥，從而發揮抗抑郁和抗焦慮效應。

在應激狀態下，機體啟動免疫反應來識別、評估和適應應激源，導致小膠質細胞激活，從而引發局部和全身炎癥反應，誘發抑郁、焦慮等癥狀［21］。LPS 是革蘭陰性菌外膜的主要成分。小鼠ip 給予LPS 約2 h 后，血液中促炎細胞因子的釋放達到峰值，小鼠產生發熱、厭食及運動和社會互動減少等行為，持續6 h；在LPS處理后24 h可觀察到小鼠抑郁樣行為的產生［22-24］。LPS 被廣泛用于誘導嚙齒類動物的抑郁、焦慮樣狀態［25-26］。文獻報道，小鼠單次ip 給予LPS 不但能夠誘導抑郁樣行為，表現為強迫游泳不動時間的延長，還能影響小鼠的自發活動，表現為開場實驗運動距離和站立次數的減少［27］。本課題組對這一模型進行改良發現，通過間隔5 d 2 次ip 給予LPS（0.5 mg·kg-1）的方式，可在不影響小鼠自發活動的前提下誘導小鼠產生穩定的抑郁樣行為［28］。本課題組以往研究表明，在大鼠慢性不可預知性應激等多個模型上，ig 給予YL-0919（1.25～2.5 mg·kg-1）3～5 d 即可表現出顯著的抗抑郁行為效應［29-30］。本研究選取前期研究中的有效劑量，發現在改良的LPS 模型上，連續5 d ig 給予YL-0919 2.5 mg·kg-1亦顯著縮短小鼠強迫游泳不動時間，并增加小鼠在開場中央區的停留時間和進入中央區次數。在該模型上，與經典抗抑郁藥物氟西汀的起效時間相比［30］，YL-0919 表現出快速起效的抗抑郁和抗焦慮效應。本課題組前期研究發現，BD1047（4 mg·kg-1）可阻斷YL-0919 的抗抑郁效應［4］，因此本實驗也延續了這一給藥方式，結果發現，BD1047 可阻斷YL-0919 快速起效抗抑郁和抗焦慮作用。

NLRP3作為一種存在于胞質的蛋白復合體，可在各種應激刺激下快速組裝成有功能的炎癥小體，后者能進一步激活胱天蛋白酶1，促進細胞因子IL-1β 前體蛋白加工為成熟的IL-1β，使其釋放到胞外啟動下游炎癥反應，誘導更多的促炎因子如IL-6和腫瘤壞死因子α 等的合成和釋放［31］。典型抗抑郁藥物氟西汀可通過抑制炎癥小體NLRP3 的活化對抑郁癥產生治療作用［32］。有研究表明，IL-1β 作為一種促炎因子，其在腦脊液中的濃度與抑郁癥嚴重程度呈正相關，且IL-1β 能激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，可能參與抑郁癥的發生［33］。在慢性束縛應激模型上，小鼠前額葉皮質IL-1β 表達顯著上調，而給予IL-1β 受體拮抗劑可改善小鼠的抑郁樣行為，提示IL-1β 在抑郁癥的發病和治療中均具有重要作用［34］。本研究結果表明，YL-0919 不僅抑制腦內NLRP3蛋白的表達水平，而且能抑制小膠質細胞系BV2 細胞IL-1β和IL-6mRNA 水平，提示YL-0919對NLRP3/IL-1β/IL-6 途徑的干預可能是其抗抑郁治療的重要機制之一，且該效應能被Sig-1R拮抗劑BD1047 或NE-100 所阻斷。文獻報道，NE-100（10 μmol·L-1）顯著阻斷Sig-1R 激動劑噴他佐辛在BV2 細胞上的抗炎作用［35］。本研究結果提示，Sig-1R 可能介導YL-0919 對抑郁癥和炎癥反應的調控，小膠質細胞上的Sig-1R 可能是潛在的抗炎和抗抑郁靶點。

綜上，本研究采用優化的LPS 模型，發現YL-0919 可能通過激活Sig-1R 發揮快速抗抑郁和抗焦慮效應，并對機體炎癥反應和小膠質細胞過度激活產生調節作用。