鹽酸右美托咪定通過抑制細(xì)胞焦亡發(fā)揮腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用

趙海峰，范鳴玥，陳 亮，秦 澤，李 紅，楊素勉

（1.石家莊市第四醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊 050000；河北省人民醫(yī)院 2.神經(jīng)內(nèi)科，3.眼科，河北 石家莊 050051）

治療腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI）的長(zhǎng)期目標(biāo)是減少腦缺血相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，目前已有一系列藥物和介入療法可以緩解CIRI 誘導(dǎo)的大腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡［1］。氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡等是CIRI 過程中重要的損傷機(jī)制［2］。目前臨床上的藥物治療效果并不理想，研究CIRI發(fā)病機(jī)制及有效的治療藥物是當(dāng)前急需解決的問題。

鹽酸右美托咪定（dexmedetomidine hydrochloride，DEX）是一種高選擇性的ɑ2腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗焦慮作用，常作為鎮(zhèn)靜和麻醉劑，能有效緩解患者的煩躁和焦慮情緒［3］。有研究表明，DEX 對(duì)手術(shù)中顱腦損傷患者具有較好的鎮(zhèn)靜作用，對(duì)患者腦組織有一定的保護(hù)作用［4］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，DEX 可通過上調(diào)大鼠腦組織中微RNA-381 表達(dá)降低炎癥反應(yīng)，在大鼠CIRI 中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［5］。

細(xì)胞焦亡可通過多種途徑參與缺血性腦卒中的發(fā)展過程，抑制細(xì)胞焦亡可減輕缺血性腦卒中引發(fā)的腦損傷［6］。GSDMD是gasdermins（GSDM）家族成員，為胱天蛋白酶1的底物，是細(xì)胞焦亡的執(zhí)行者。GSDMD 的C 端和N 端均存在保守的結(jié)構(gòu)域，其中N 端具有細(xì)胞毒性，可與脂質(zhì)組分結(jié)合在細(xì)胞膜上形成孔洞。GSDMD 可被胱天蛋白酶1 切割成C 端和N 端，其N 端在細(xì)胞膜上寡聚化形成非選擇性孔道，釋放成熟的白細(xì)胞介素18（interleukin-18，IL-18）和IL-1β，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生［7-8］。此外，細(xì)胞焦亡與NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體通路相關(guān)［9］，其主要功能是激活胱天蛋白酶1前體形成胱天蛋白酶1，活化胱天蛋白酶1剪切IL-1β前體和IL-18 前體形成成熟的IL-1β 和IL-18，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致CIRI［10］。細(xì)胞焦亡信號(hào)分子被認(rèn)為是對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷進(jìn)行干預(yù)的靶點(diǎn)之一。本研究評(píng)估DEX對(duì)氧糖剝奪再復(fù)供（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）處理的PC12細(xì)胞及大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）大鼠腦組織中焦亡相關(guān)蛋白GSDMD-N 段（GSDMD-N）、NLRP3和胱天蛋白酶1表達(dá)及IL-1β和IL-18水平的影響，探討DEX減輕CIRI的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

DEX（貨號(hào)：SML0956），江蘇星辰醫(yī)藥有限公司；PC12細(xì)胞，上海通派生物科技有限公司；IL-1β和IL-18 ELISA 試劑盒及胱天蛋白酶1 活性檢測(cè)試劑盒（NEMC041.96），深圳欣博盛生物科技有限公司；兔抗大鼠NLRP3（ab263899）、胱天蛋白酶1（ab207802）、GSDMD-N（ab215203）和GAPDH（ab8245）單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（ab6721），英國Abcam 公司；焦亡抑制劑VX-7652，武漢ABclonal 公司；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清，美國Gibco 公司；1% Tritonx-100、RIPA裂解液、CCK-8 試劑盒、TTC 染液和BCA 蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（L-lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒，南京建成生物工程研究所；凝膠電泳系統(tǒng)（型號(hào)：1658001），美國Bio-Rad 公司；CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：Forma?3）和酶標(biāo)儀（型號(hào)：Multiskan SkyHigh），美國Thermo 公司；熒光顯微鏡（型號(hào)：IX71），日本Olympus 公司；LC-LX-HR165A 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海力辰科技有限公司。

1.2 細(xì)胞OGD/R模型構(gòu)建和分組

PC12 細(xì)胞以無糖、無血清細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃，0.2% O2、5% CO2、95% N2條件下培養(yǎng)3 h，然后更換為含糖、含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，置 于37 ℃，5% CO2培養(yǎng) 箱 中 培 養(yǎng)24 h［11］制 備OGD/R 模型。①PC12 細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、OGD/R 模型組、模型+DEX 2，5 和10 μmol·L-1組，給藥組PC12細(xì)胞于OGD/R處理后給予DEX，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②PC12 細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、OGD/R 模型組、模型+VX-765 2 μmol·L-1組 和 模型+VX-7652 μmol·L-1+DEX 10 μmol·L-1組，給藥組PC12細(xì)胞于OGD/R處理后給予VX-7652或同時(shí)給予VX-7652和DEX，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每組3個(gè)復(fù)孔。

1.3 動(dòng)物、模型制備、分組和樣本制備

雄性SD 大鼠25只，體重180～230 g，SPF級(jí)，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2021-0013。飼養(yǎng)于石家莊市第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，將大鼠分為假手術(shù)組、MCAO/R模型組、模型+DEX 25，50，100 μg·kg-1組，每組5只。大鼠術(shù)前禁食24 h，模型組及模型+DEX 給藥組大鼠采用線栓法制備MCAO/R 模型，ip 給予4%水合氯醛ip 麻醉大鼠后仰臥固定，切開皮膚暴露右側(cè)頸動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈主干處剪一小口，將線栓由剪口部分緩慢向顱腦方向插入阻斷大腦中動(dòng)脈的血流供應(yīng)，40 min后將線栓拔出完成再灌注。假手術(shù)組大鼠僅分離暴露血管，模型+DEX組大鼠在再灌注40 min后ip給予相應(yīng)劑量DEX。模型組和假手術(shù)組ip給予等體積生理鹽水。給藥24 h后處死大鼠，取出完整腦組織。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔3×103個(gè)細(xì)胞，按1.2 分組①方法分組。細(xì)胞孵育48 h 后，在各組細(xì)胞中添加10 μL CCK-8 溶液，在37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 的吸光度（A450nm）值。以不含細(xì)胞只加試劑的孔作為空白對(duì)照孔進(jìn)行調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=〔（實(shí)驗(yàn)組A450nm-空白對(duì)照組A450nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A450nm-空白對(duì)照組A450nm）〕×100%。

1.5 試劑盒檢測(cè)PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH釋放

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96 孔板中，按1.2 分組①處理細(xì)胞。另設(shè)空白組（不接種細(xì)胞，作為試劑背景對(duì)照）和完全裂解組（只接種細(xì)胞，檢測(cè)前30 min 加入10 μL 1% Tritonx-100 裂解液，以裂解細(xì)胞充分釋放LDH）。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清液，采用LDH 試劑盒在440 nm 測(cè)定溶液吸光度值（A440nm），計(jì)算LDH 釋放率。LDH 釋放率（%）=〔（實(shí)驗(yàn)組A440nm-空白組A440nm）/（完全裂解組A440nm-空白組A440nm）〕×100%。

1.6 免疫熒光染色法檢測(cè)PC12 細(xì)胞中GSDMD-N染色陽性細(xì)胞比例

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中，按1.2分組①處理細(xì)胞。OGD/R 處理細(xì)胞24 h 后，給藥組加入DEX 2，5 和10 μmol·L-1，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。PBS 洗滌2 次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min；PBS 洗滌2 次，然后用含2%牛血清白蛋白和1%牛血清的PBS 室溫孵育60 min，以阻斷非特異性結(jié)合。加入抗GSDMD-N 抗體（1∶500）4 ℃孵育過夜。加DAPI染核15 min，用熒光顯微鏡觀察。染色陽性細(xì)胞為表達(dá)GSDMD-N 蛋白（紅色熒光）的細(xì)胞，計(jì)算單位面積下陽性染色細(xì)胞比例。

1.7 Western 印跡法檢測(cè)PC12 細(xì)胞和大鼠腦組織中NLRP3、胱天蛋白酶1和GSDMD-N表達(dá)

收集并裂解1.2 分組①和②的細(xì)胞和1.3 大鼠腦組織，隨后進(jìn)行蛋白定量、上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入NLRP3、胱天蛋白酶1、GSDMD-N 和GAPDH 一抗稀釋液（1∶1000）后于4 ℃孵育過夜。次日加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000）4 ℃孵育2 h。隨后用凝膠成像儀對(duì)蛋白條帶進(jìn)行成像，并用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行積分吸光度掃描分析，以GAPDH蛋白為內(nèi)參，用目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度值的比值反映目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 ELlSA 測(cè)定PC12 細(xì)胞培養(yǎng)上清液和大鼠腦組織中l(wèi)L-1β和lL-18含量

收集1.2 分組①和②細(xì)胞培養(yǎng)上清液以及1.3分組的大鼠腦組織，按照試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀在450 nm分別測(cè)定PC12細(xì)胞上清液和大鼠腦組織勻漿液吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-1β和IL-18含量（ng·L-1）。

1.9 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

1.3 分組大鼠，分別于給藥后2 和24 h 采用Longa 神經(jīng)功能評(píng)分法[12]評(píng)估各組大鼠的神經(jīng)功能。0 分為無神經(jīng)損傷癥狀，1分為提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢無法完全伸直，2 分為行走時(shí)出現(xiàn)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈，3分為行走時(shí)向病灶對(duì)側(cè)跌倒，4分為喪失意識(shí)、且無法自發(fā)行走。

1.10 腦梗死體積百分比測(cè)定

將1.3分組的大鼠斷頭取腦，剝離大腦于-20 ℃冰箱冷凍20 min后，立即作冠狀位等距離連續(xù)切片（厚度2 mm），共切分為5片。用1%的TTC 染液在37 ℃水浴中避光染色30 min，加入4%多聚甲醛固定24 h。使用Image J 軟件對(duì)切片進(jìn)行掃描，分析梗死側(cè)腦片非梗死區(qū)面積和正常側(cè)腦片面積。梗死側(cè)腦片的非梗死面積乘以腦片的厚度即梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球體積，正常側(cè)腦片面積乘以腦片厚度即正常側(cè)腦半球體積。腦梗死體積百分比（%）=（正常側(cè)腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球的體積）/正常側(cè)大腦半球體積×100%。

1.11 比色法檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)胱天蛋白酶1活性

1.3 分組的大鼠給藥后24 h，斷頭取腦。分離出大腦皮質(zhì)，根據(jù)大腦皮質(zhì)質(zhì)量加入生理鹽水（大腦皮質(zhì)∶生理鹽水=1∶9），超聲勻漿后離心收集上清液。按胱天蛋白酶1活性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450 nm 測(cè)定溶液吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組大鼠大腦皮質(zhì)胱天蛋白酶1活性（kU·g-1）［10］。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DEX對(duì)OGD/R損傷PC12細(xì)胞存活率的影響

CCK-8 結(jié)果（圖1）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，OGD/R 模型組PC12 細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，模型+DEX 2，5和10 μmol·L-1組PC12細(xì)胞存活率均顯著升高（P＜0.01）。

Fig.1 Effect of dexmedetomidine hydrochloride（DEX）on proliferation of PC12 cells exposed to oxygen-glucose deprivation/reperfusion（OGD/R）by CCK-8 assay. PC12 cells were exposed to oxygen-glucose deprivation/reperfusion（OGD/R，model）before being placed in DMEM medium containing DEX（2，5，10 μmol·L-1）for 48 h. The cells were divided into cell control group，model group（OGD/R），model+DEX 2 μmol·L-1 group，model+DEX 5 μmol·L-1 group and model+DEX 10 μmol·L-1 group. Cell viability（%）=［（A450 nm of experimental group-A450 nm of blank control group）/（A450 nm of cell control group-A450 nm of blank control group）］×100%. ±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.2 DEX 對(duì)OGD/R 損傷PC12 細(xì)胞LDH 釋放率的影響

與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組PC12 細(xì)胞LDH 釋放率顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，模型+DEX 2，5 和10 μmol·L-1組PC12 細(xì)胞LDH 釋放率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，圖2）。

Fig.2 Effect of DEX on lactate dehydrogenase（LDH）release of PC12 cells exposed to OGD/R. See Fig.1 for the cell treatment. LDH release rate（%）=［（A440 nm of experimental group-A440 nm of blank group）/（A440 nm of complete lysis group-A440 nm of blank group）］×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.3 DEX 對(duì)OGD/R 損 傷PC12 細(xì)胞GSDMD-N 蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光染色結(jié)果（圖3）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組GSDMD-N 蛋白陽性比例顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+DEX處理組PC12細(xì)胞GSDMD-N 蛋白陽性比例顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 DEX 對(duì)OGD/R 損傷PC12 細(xì)胞及MCAO/R 大鼠腦組織GSDMD-N、NLRP3、胱天蛋白酶1 蛋白表達(dá)的影響

2.4.1 PC12細(xì)胞

Western 印跡結(jié)果（圖4）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+DEX 組降低GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.4 Effect of DEX on GSDMD-N，NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3（NLRP3）and caspase 1 expressions in OGD/R-treated PC12 cells by Western blotting. See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A. IA：integrated absorbance. ±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Western 印跡結(jié)果（圖5）顯示，與模型組相比，模 型+VX-765 2 μmol·L-1組細(xì) 胞焦 亡相 關(guān)蛋 白GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1 表達(dá)顯著降低（P＜0.01），表明VX-765 可以抑制OGD/R 所致的PC12 細(xì)胞焦亡；與模型+VX-765 2 μmol·L-1組相比，模型+VX-765 2 μmol·L-1+DEX 10 μmol·L-1組PC12 細(xì)胞GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1 蛋白表達(dá)無顯著差異。

Fig.5 Effect of VX-765 combined with DEX on protein expressions of GSDMD-N，NLRP3 and caspase-1 in OGD/R-treated PC12 cells by Western blotting. PC12 cells were exposed to OGD/R before being placed in DMEM medium containing VX-765 2 μmol·L-1 or VX-765 2 μmol·L-1+DEX 10 μmol·L-1 for 48 h. B was the semi-quantative result of A. ±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.4.2 大鼠腦組織

Western 印跡結(jié)果顯示（圖6），與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+DEX 組GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），提示DEX 能夠抑制細(xì)胞的焦亡，具有保護(hù)腦組織的作用。

Fig.6 Effect of DEX on protein expressions of GSDMD-N，NLRP3 and caspase 1 in brain tissue of rats after middle cerebral artery occlusion/reperfusion（MCAO/R）by Western blotting. The rats were divided into sham group，MCAO/R model group，model+DEX 25，50 and 100 μg·kg-1 group. DEX was administered by ip at 40 min after reperfusion.B was the semi-quantative result of A.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with sham group；##P＜0.01，compared with model group.

2.5 DEX 對(duì)OGD/R 損傷PC12 細(xì)胞培養(yǎng)上清液及MCAO/R大鼠腦組織lL-1β和lL-18水平的影響

2.5.1 PC12細(xì)胞

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-18水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+DEX組IL-1β和IL-18水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，表1），提示DEX能夠抑制PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)。與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組IL-1β和IL-18水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+VX-765 2 μmol·L-1組細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18水平顯著降低（P＜0.01，表2）；與模型+VX-765 2 μmol·L-1組相比，模型+VX-765 2 μmol·L-1+DEX 10 μmol·L-1組PC12 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-18 的水平無顯著差異（表2）。上述結(jié)果提示，DEX 保護(hù)OGD/R 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷依賴于調(diào)控細(xì)胞焦亡。

Tab.1 Effect of DEX on interleukin-1β（lL-1β）and lL-18 levels in PC12 cell supernuant after OGD/R by ELlSA

Tab.2 Effect of VX-765 combined with DEX on lL-1β and lL-18 levels in supernuant of PC12 cells after OGD/R by ELlSA

2.5.2 大鼠腦組織

表3結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中IL-1β 和IL-18 水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+DEX 給藥組大鼠腦組織IL-1β 和IL-18的水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），提示DEX能夠抑制MCAO/R腦組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

Tab.3 Effect of DEX on lL-1β and lL-18 levels in brain tissue of rats after MCAO/R by ELlSA

2.6 DEX對(duì)MCAO/R大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高（P＜0.01），說明CIRI能夠造成大鼠的神經(jīng)功能缺陷。與模型組比較，模型+DEX 給藥組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），說明DEX可緩解CIRI大鼠的神經(jīng)功能缺陷（表4）。

Tab.4 Effect of DEX on neuromotor function of rats after MCAO/R

2.7 DEX對(duì)MCAO/R大鼠腦梗死體積的影響

TTC 染色結(jié)果（圖7）顯示，與假手術(shù)組相比，MCAO/R 模型組腦梗死體積百分比顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，模型+DEX 組腦梗死體積百分比顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.7 Effect of DEX on cerebral infraction volume of MCAO/R-treated rats by TTC staining. See Fig.6 for the rat treatment. B was the semi-quantitative result of A. Percentage of cerebral infarction volume（%）=（volume of normal cerebral hemisphere-volume of non-infarcted cerebral hemisphere of infarction side）/volume of normal cerebral hemisphere×100%. ±s，n=5.＊＊P＜0.01， compared with sham group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.8 DEX 對(duì)MCAO/R 大鼠大腦皮質(zhì)中胱天蛋白酶1活性的影響

表5結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠大腦皮質(zhì)胱天蛋白酶1 活性顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，模型+DEX 50和100 mg·kg-1組大鼠大腦皮質(zhì)胱天蛋白酶1活性顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.5 Effect of DEX on caspase 1 activity in brain tissue of rats after MCAO/R

3 討論

近年來，神經(jīng)元焦亡已被證實(shí)參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的早期病理過程，包括創(chuàng)傷性腦損傷、CIRI和脊髓損傷［13］。早期研究表明，DEX 可以預(yù)防CIRI［5］。然而，DEX 對(duì)CIRI 神經(jīng)細(xì)胞焦亡的作用尚不明確。在本研究中，利用體內(nèi)MCAO/R 大鼠模型和體外OGD/R 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型，證實(shí)OGD/R 損傷后PC12 細(xì)胞活力降低，細(xì)胞內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1 蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子IL-1β 和IL-18水平明顯升高；不同濃度DEX均可提高OGD/R后細(xì)胞存活率，降低焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)和炎癥因子水平。DEX 可部分降低大鼠腦梗死體積及神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分，降低缺血腦組織中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。上述結(jié)果共同提示DEX 通過抑制細(xì)胞焦亡發(fā)揮抗CIRI作用。

細(xì)胞焦亡屬于胱天蛋白酶1 依賴性細(xì)胞死亡，是CIRI 的機(jī)制之一，通常是由GSDMD 介導(dǎo)的細(xì)胞炎性壞死，而激活GSDMD的正是NLRP3炎癥小體通路中的胱天蛋白酶1［13］。本研究顯示，OGD/R 可導(dǎo)致PC12細(xì)胞胱天蛋白酶1、IL-1β和IL-18大量釋放，而DEX 可以降低胱天蛋白酶1 以及IL-1β 和IL-18 水平，抑制神經(jīng)細(xì)胞焦亡。NLRP3 炎癥小體能在腦缺血再灌注中活化，而活化的NLRP3炎癥小體可促進(jìn)炎癥因子的釋放，引起病理性炎癥反應(yīng)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R 可激活NLRP3，進(jìn)而活化胱天蛋白酶1 和GSDMD-N，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。VX-765 是細(xì)胞焦亡抑制劑，VX-765 與DEX 聯(lián)合用藥結(jié)果顯示，PC12 細(xì)胞用VX-765 處理后，DEX 對(duì)焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)以及IL-1β 和IL-18 水平的抑制作用消失，進(jìn)一步證實(shí)了DEX 能特異性抑制OGD/R 損傷后PC12細(xì)胞的焦亡。

此外，在大鼠MCAO/R 模型中，DEX 能改善MCAO/R 大鼠神經(jīng)功能。模型組大鼠腦組織中胱天蛋白酶1、NLRP3 和GSDMD-N 蛋白表達(dá)、腦梗死體積及IL-1β 和IL-18 水平顯著增加；DEX 能減少M(fèi)CAO/R大鼠腦梗死體積，降低NLRP3、GSDMD-N和胱天蛋白酶1 蛋白表達(dá)，下調(diào)IL-1β和IL-18水平，降低胱天蛋白酶1活性，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，DEX能夠減弱腦組織細(xì)胞焦亡，改善大鼠CIRI損傷。

有研究表明，DEX 可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡發(fā)揮對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用［15］。除小膠質(zhì)細(xì)胞外，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血中也起重要作用［16］。有文獻(xiàn)報(bào)道，DEX 能通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的焦亡對(duì)腦損傷起到保護(hù)作用［17］。上述結(jié)果提示，DEX 在治療腦缺血損傷過程中對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均有調(diào)控作用，而本研究結(jié)果進(jìn)一步提示，DEX 治療腦缺血損傷的機(jī)制亦與抑制神經(jīng)細(xì)胞焦亡有關(guān)。由于體內(nèi)信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制復(fù)雜且受多因素影響，未來需進(jìn)一步深入研究DEX在缺血性腦損傷中的調(diào)控機(jī)制，并探討DEX 在腦缺血損傷中對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞共同的藥效靶點(diǎn)。

綜上所述，DEX 對(duì)CIRI 具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低大腦皮質(zhì)焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)和減少炎癥因子IL-1β 和IL-18 水平有關(guān)。本研究為臨床治療CIRI提供了理論依據(jù)。