醋酸鉛暴露對PC12細胞凋亡與自噬的影響及可能機制

張 誼，王立暉，陳月芳，李永金，柳浦青

（1.南通大學附屬丹陽醫院，江蘇省丹陽市人民醫院，江蘇 丹陽 212300；2.江蘇大學醫學院藥理學教研室，江蘇 鎮江 212013；3.浙江中醫藥大學附屬第二醫院，浙江 杭州 310005）

鉛是一種普遍存在于環境中的重金屬。長期接觸鉛可使神經系統發生不可逆損傷，導致學習和記憶功能減退［1］。在模擬阿爾茨海默病研究中，抑制神經細胞凋亡可改善大鼠行為和認知功能［2］；而抑制自噬對小鼠神經元具有保護作用［3］，表明神經系統損傷過程中存在細胞凋亡與自噬。

沉默信息調節因子1（sirtuin1，Sirt1）是一種脫乙酰酶，可通過激活下游底物——叉頭框蛋白轉錄因子3a（forkhead box O3a，FoxO3a）介導神經細胞的生成、凋亡與自噬［4-5］。重金屬錳暴露可導致神經細胞中Sirt1 蛋白降解，促使FoxO3a 蛋白表達上調及乙酰化水平增加，誘導細胞損傷［6］。在H2O2誘導的神經毒性反應中，阻斷Sirt1/FoxO3a 信號途徑可抑制細胞促凋亡蛋白和自噬蛋白的表達，減輕神經細胞損傷［7］，表明Sirt1/FoxO3a 信號通路參與了細胞凋亡和自噬。本實驗室前期研究發現，神經細胞的損傷伴隨氧化應激與細胞凋亡［8］，但目前仍不清楚鉛暴露是否可誘導神經細胞自噬。

本研究選用大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12 細胞作為實驗對象，建立醋酸鉛〔Pb（Ac）2〕暴露細胞模型，探討鉛暴露對PC12 細胞凋亡與自噬的作用及其與Sirt1/FoxO3a信號通路之間的關系，為研究及預防鉛神經毒性相關性疾病提供實驗支持與理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12 細胞株，中國科學院上海細胞庫。DMEM 培養基、胰蛋白酶、單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）試劑盒，美國Gibco公司；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；Pb（Ac）2，美國Sigma 公司；MTT，美國Amresco 公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒，碧云天生物技術研究所；吖啶橙/溴化乙錠（acridine orange/ethidium bromide，AO/EB）試劑盒，北京Solarbio 公司；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒，美國Molecular Probes 公司。兔抗人Sirt1、FoxO3a、叉頭蛋白M1（forkhead box protein M1，FoxM1）和P62 蛋白多克隆抗體，美國ImmunoWay 公司；兔抗大鼠Bcl-2 相互作用蛋白1（Bcl-2 interacting coiled-coil protein 1，Beclin1）多克隆抗體，武漢ABclonal 公司；兔抗小鼠微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）多克隆抗體，美國Proteintech公司；小鼠抗人GAPDH 單克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG 二抗，美國GeneTex 公司；顯影劑，美國Millipore 公司。其余試劑均為市售國產分析純。

SW-CJ-2G 型超凈臺，蘇州凈化設備總廠；CO2細胞培養箱，上海Heal Force 公司；CKX53 型倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；UPK-I-10T 型超純水機，成都超純科技有限公司；CP124S型電子分析天平，德國賽多利斯公司；680型酶標儀和1658001 型電泳儀，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統，南京麥高德生物科技公司；X1R 型冷凍離心機，美國Thermo Fisher 公司；Axio Scope A1 型熒光顯微鏡，德國Carl Zeiss公司；2400F超聲波粉碎機，新芝生物科技公司；FACS CantoⅡ型流式細胞儀，美國BD公司。

1.2 細胞培養和分組處理

PC12 細胞置高糖DMEM 培養基中，置于含5%的CO2和95%空氣的37 ℃培養箱中孵育，取對數生長期細胞進行實驗。細胞分為細胞對照組（空白培養基）和Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1組，給予Pb（Ac）2暴露24 h后，收集細胞進行實驗。

1.3 MTT 法和比色法檢測細胞存活率和細胞外液LDH含量

取對數生長期的PC12 細胞接種于96 孔板中，按1.2 分組處理后，棄去上清，每孔加入10 μL MTT 0.5 g·L-1，于37 ℃繼續培養4 h 后棄去培養液，加入100 μL DMSO，振勻后于490 nm 處測定各孔吸光度（A490nm）值。細胞存活率（%）=（1-處理組A490nm/細胞對照組A490nm）×100%。

按照試劑盒說明書進行操作，收集1.2 分組細胞上清液，在波長450 nm 處檢測各孔吸光度（A450nm）值，計算各組LDH含量。

1.4 AO/EB染色觀察細胞凋亡

取對數生長期PC12 細胞接種于6 孔板中，按1.2 分組處理后，棄培養液并用PBS 洗滌2 次，在各孔加入2 mL 按比例配制好的AO/EB 混合染液，4 ℃避光反應10 min，將6 孔板置于熒光顯微鏡下，每組隨機挑選10 個視野，觀察各組細胞染色情況，核染色質呈橙紅色熒光的為凋亡細胞。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

取1.2 分組處理的細胞，用預冷的PBS 洗2 遍后加入400 μL 緩沖液，輕輕混勻細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 溶液，避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 MDC染色法觀察細胞自噬

取對數生長期PC12 細胞接種于裝有玻璃片的6 孔板中，按1.2 分組處理后，棄去培養基，用PBS洗滌，加入MDC 染料室溫避光染色30 min。吸去染料后，加入4%多聚甲醛固定10 min，待玻璃片晾干后置于熒光顯微鏡下觀察。自噬細胞出現綠色自噬空泡，以綠色熒光強度表示細胞自噬程度。

1.7 免疫熒光法檢測細胞內Beclin1的表達

取1.2收集的細胞，用0.3% Triton X-100透化，羊血清封閉后，滴加抗Beclin-1 抗體（1∶300），4 ℃搖床反應過夜；用PBS 洗滌后加入山羊抗兔IgG二抗（1∶600），37 ℃避光反應1 h，甘油封片后置熒光顯微鏡下觀察。當細胞自噬時，Beclin1蛋白呈點狀聚集，以熒光強度反映Beclin1的表達水平。

1.8 Western 印跡法檢測細胞Sirt1，FoxO3a，FoxM1，Beclin1，LC3和P62蛋白表達水平

取1.2 收集的細胞，加入裂解液裂解提取總蛋白，并用試劑盒測定蛋白濃度。總蛋白經電泳分離并轉印至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉，繼而與一抗（Sirt1，FoxO3a，FoxM1，Beclin1，LC3 和P62 均1∶1000；GAPDH，1∶7000）于4 ℃搖床反應過夜。洗滌數次后，將膜和相應山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗（1∶5000）在室溫下反應1 h，加入顯影劑，在凝膠成像系統上進行掃描并拍照，Image J 軟件分析各條帶積分吸光度值。以目標蛋白與GAPDH 的積分吸光度值比值表示目標蛋白的相對表達量，LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ蛋白表達比值表示細胞自噬水平。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 Pb（Ac）2對PC12 細胞存活率和細胞外液LDH含量的影響

MTT 法檢測結果如圖1A所示，與細胞對照組相比，處理24 h 后，Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1組PC12 細胞存活率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。如圖1B所示，Pb（Ac）2可引起PC12細胞外液LDH 含量增加。與細胞對照組相比，Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1組細胞外液LDH 含量均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），表明Pb（Ac）2誘導PC12細胞損傷。

Fig.1 Effect of lead acetate（Pb（Ac）2）on cell viability（A）and lactate dehydrogenase（LDH）content（B）in extracellular fluid of PC12 cells by MTT and colorimetry. After exposure to Pb（Ac）2 0（cell control），100，200 and 400 μmol·L-1 at 37 ℃for 24 h，cell viability and LDH content in extracellular fluid were determined. Cell viability（%）=（1-A490 nm of treatment group/A490 nm of cell control group）×100%.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.2 Pb（Ac）2對PC12細胞凋亡的影響

PC12 細胞經Pb（Ac）2處理24 h 后經AO/EB雙染色，凋亡的細胞表現出AO/EB 染色雙陽性，熒光疊加后呈現出均勻一致的橙紅色圓形；而對照組細胞AO 染色均勻，且幾乎無EB 染色陽性，表明無明顯凋亡（圖2）。

流式檢測結果如圖3 所示，與細胞對照組相比，Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1組細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.01），表明Pb（Ac）2可誘導PC12細胞凋亡。

Fig.3 Effect of Pb（Ac）2 on apoptotic rate of PC12 cells detected by flow cytometry. See Fig.1 for the cell treatment. B was the quantitative result of A. ±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 Pb（Ac）2對PC12細胞自噬的影響

如圖4A 所示，細胞對照組細胞幾乎未見熒光和自噬泡，Pb（Ac）2100 μmol·L-1組細胞內熒光雖弱但自噬泡已開始出現，Pb（Ac）2200 μmol·L-1組MDC點狀熒光信號顯著增強，Pb（Ac）2400 μmol·L-1組細胞周圍呈強烈綠色熒光，提示細胞內出現大量自噬空泡。定量結果（圖4B）表明，與細胞對照組相比，Pb（Ac）2各濃度組熒光強度顯著增強（P＜0.01），表明Pb（Ac）2染毒后PC12細胞自噬增強。

Fig.4 Effect of Pb（Ac）2 on autophagy of PC12 cells determined by monodansylcadaverine staining. See Fig.1 for the cell treatment. B was the quantitative result of A. ±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group. The arrows indicate autophagic bubbles.

2.4 Pb（Ac）2對PC12細胞Beclin1定位的影響

圖5所示，細胞對照組Beclin1在細胞質微弱表達，Pb（Ac）2200 μmol·L-1組細胞細胞質中Beclin1表達明顯增強，Pb（Ac）2400 μmol·L-1組細胞質內Beclin1 呈現大量點狀聚集且熒光強度加強。表明細胞發生了明顯自噬，細胞內自噬體數量增多。

Fig.5 Effect of Pb（Ac）2 on nucleic accumulation of Bcl-2 interacting coiled-coil protein（Beclin1）in the PC12 cells by immunofluorescence. See Fig.1 for the cell treatment. Arrows show the representative Beclin1 accumulation.

2.5 Pb（Ac）2對細胞自噬相關蛋白Sirt1，FoxO3a，FoxM1，Beclin1，LC3和P62表達的影響

Western 印跡法結果（圖6）顯示，與細胞對照組相比，Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1組細胞內Sirt1（P＜0.01）和FoxO3a蛋白（P＜0.05，P＜0.01）表達明顯上調，同時自噬相關蛋白Beclin1 蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01）和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（P＜0.01）也明顯增加，P62 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）；Pb（Ac）2200 和400 μmol·L-1組細胞FoxM1蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討論

本研究采用Pb（Ac）2暴露誘導PC12 細胞損傷模型，發現Pb（Ac）2可顯著誘導細胞凋亡，且細胞內自噬程度明顯增加，自噬相關蛋白表達顯著增多，提示細胞自噬參與了Pb（Ac）2誘導的細胞凋亡過程。

自噬是一種細胞程序性死亡的機制，常由多種應激反應引起。大量研究表明，抑制細胞自噬可減少神經細胞的死亡，反之可促進細胞死亡［9-11］。本研究中，隨著Pb（Ac）2濃度的增加，PC12 細胞內自噬泡增多，且Beclin1在PC12 細胞中的熒光強度明顯增強，表明Pb（Ac）2促進PC12 細胞發生自噬。Beclin1，LC3 和P62 都是細胞自噬的重要標志物。其中，Beclin1 水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與自噬呈正相關，P62 蛋白表達水平與細胞自噬呈負相關［12-14］。本研究通過Western印記法檢測Beclin1，LC3 和P62 蛋白的表達，發現Pb（Ac）2暴露誘導PC12 細胞自噬相關蛋白Beclin1 表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，P62蛋白表達降低，進一步證實細胞發生了自噬。

細胞自噬與凋亡之間存在交聯，但兩者的互作關系尚不明確［15］。有研究發現，抑制新生大鼠神經元自噬后，腦神經元凋亡增加［16］；另有研究發現，抑制大鼠海馬體中神經元自噬后，大鼠腦損傷及神經元凋亡率明顯降低［17］，表明細胞自噬與凋亡參與了細胞的死亡過程。本實驗室前期研究也發現，用熒光染料Hoechst33342 對Pb（Ac）2處理的PC12 細胞染色后，顯微鏡下可觀察到細胞核明顯皺縮且藍色熒光增強［18］，提示細胞出現了凋亡。本研究中，用AO/EB 染色后，隨Pb（Ac）2濃度增加，細胞橙色熒光增強，綠色熒光逐漸減弱，表明細胞損傷中發生自噬的同時伴有細胞凋亡，同時，流式細胞檢測結果表明，Pb（Ac）2可誘導細胞發生明顯凋亡，與之前實驗結果相一致。

Sirt1 在調節血管穩態、細胞自噬和凋亡中發揮重要作用［4］。FoxO3a是Sirt1 的下游靶基因，Sirt1可通過去乙酰化調節FoxO3a 的表達，參與調控細胞氧化應激、凋亡和增殖等過程［19］。而FoxM1 是FoxO3a 的下游基因，也是FoxO3a 的直接轉錄靶點，但關于FoxO3a 和FoxM1 的表達相關性報道不一［20-21］。本研究中，不同濃度Pb（Ac）2作用細胞后，可使細胞內Sirt1 和FoxO3a 蛋白表達明顯上調，而FoxM1 表達下調，表明在PC12 細胞損傷的過程中可能有Sirt1/FoxO3a相關信號通路的參與，并存在FoxO3a負向調節下游效應基因FoxM1的可能。

綜上所述，本研究發現Pb（Ac）2可顯著誘導PC12細胞損傷，且細胞自噬及Sirt1/FoxO3a信號通路可能參與該損傷過程。在后續研究中，將使用自噬抑制劑加以干預，進一步證實細胞凋亡和自噬及Sirt1/FoxO3a信號通路在鉛誘導PC12細胞損傷中確切機制。