恩施州不同地區鲊廣椒微生物多樣性與功能分析

張振東，王克英，諶洪婷，羅 文，趙慧君，郭 壯，王玉榮*

（1.黔南民族師范學院 生物科學與農學院，貴州 都勻 558000；2.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；3.湖北文理學院 乳酸菌生物技術與工程襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053）

我國地域廣闊，涵蓋了多種氣候類型，因此能夠種植許多蔬菜。但是絕大多數蔬菜如辣椒等不耐儲存。而經過微生物發酵或者腌制加工成發酵蔬菜（如鲊廣椒、泡菜、酸菜等），就能存放較長時間，且微生物發酵能改善蔬菜的滋味、氣味和質構等特征[1]。鲊廣椒就是這類傳統發酵食品的代表，其在我國多個省區，如四川、湖北、重慶、貴州和湖南等地均有制作，且是日常的調味佐料，能用來制作鲊廣椒排骨、鲊廣椒土豆片、鲊廣椒炒臘肉等常見菜肴。

鲊廣椒制作技藝已經成為恩施土家族苗族自治州的州級非遺代表項目，其制作原料一般使用鮮紅辣椒和玉米粉或者大米粉，再添加大蒜、食鹽、白酒等密封發酵數月即可食用。不同地區的工藝或者原料，略有差異，但是差別不大。研究顯示，由于鲊廣椒采用自然發酵方式，未添加任何發酵劑，且制作過程中的原料和容器均未消毒處理，因此發酵過程中的菌群主要來自原料和制作環境，且由于不同地區原料和制作環境中微生物的不同而使鲊廣椒成品品質具有差異。既往研究顯示，鲊廣椒中含有復雜的微生物菌群，且主要是細菌中的乳酸菌。按照最新的乳酸菌科分類單元，鲊廣椒中常見優勢菌屬包括：伴生乳桿菌屬（Companilactobacillus），乳植物桿菌屬（Lactiplantibacillus），乳桿菌屬（Lactobacillus），魏斯氏菌屬（Weissella），明串珠菌屬（Leuconostoc），片球菌屬（Pediococcus）和促生乳桿菌屬（Levilactobacillus）[2-4]，一些鲊廣椒中還含有醋酸桿菌屬（Acetobacter），棒狀桿菌屬（Corynebacterium）和假單胞菌屬（Pseudomonas）[2，4]。

高通量測序技術具有準確率高，成本較低，且測序周期短的優點，因此在食品、醫學、環境等許多研究領域有了廣泛的應用。盡管通過高通量測序技術無法得到微生物菌株，但其不依賴于培養基和培養條件，因此對微生物菌群的解析結果不受培養基、培養條件等因素限制，得到的結果更加客觀[5]。恩施土家族苗族自治州，是湖北喀斯特地貌的主要分布區域，地理環境較為特別，因此該地區的鲊廣椒中可能含有一些特別的微生物類群。前期基于傳統培養方法得出，恩施鲊廣椒富含乳汁乳桿菌屬和粘液乳桿菌屬（Limosilactobacillus）[6]。鑒于傳統培養方法的局限性以及樣品收集數量較少，因此，為進一步明確恩施州的鲊廣椒微生物組成，本研究通過第二代高通量測序對鲊廣椒中的微生物多樣性進行測序與生物信息學分析，并進行功能預測，以期明確恩施鲊廣椒樣品中特有及核心微生物菌群，為鲊廣椒產業提供基礎數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鲊廣椒樣品：分別采集自湖北省恩施土家族苗族自治州利川市，共采集14個樣品，分別編號為LC01～LC14，樣品采集地的經緯度分別為：108.35°～109.30°E，29.70°～30.65°N；另外，還在恩施州恩施市采集了26個樣品，編號為ES01～ES26，樣品采集的區域為：109.08°～109.98°E，29.84°～30.66°N。另外，為方便進行組間分析，分別將來自利川市與恩施市的樣品編號為LC和ES。

用于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增的引物對：338F（5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC A-3'）和806R（5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTAAT-3'），由上海桑尼生物科技有限公司合成；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）Mix、Ex PremierTM脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：寶生物工程大連有限公司；E.Z.N.A.Rfood DNA試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司。

1.2 儀器與設備

EDC-810型黑金剛基因擴增儀：北京東勝創新生物科技有限公司；WD-9413B型凝膠成像分析系統、DYY-6C型電泳儀電源：北京六一生物科技有限公司；K5800H自動檢測超微量分光光度計：北京凱奧科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

鲊廣椒樣品采集自湖北省恩施土家族苗族自治州。樣品采集標準：無不良氣味與滋味，且不同編號的鲊廣椒均通過自然發酵方式制作，來自不同的家庭。樣品采集后，迅速裝入無菌瓶，然后裝入保溫箱，帶回微生物實驗室，放入-70 ℃冰箱備用。

1.3.2 PCR擴增與高通量測序

在進行樣品總DNA提取前，將樣品從冰箱中取出，使用E.Z.N.A.Rfood DNA試劑盒，按照附帶的說明提取樣品宏基因組DNA。提取完DNA后，使用瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢測提取DNA的純度和質量。將檢測合格的樣品總DNA作為模板，用于細菌16S rRNA的V3-V4區域的擴增，具體的PCR擴增體系及擴增程序參照GUO Z等[7]的方法。同樣的，將PCR產物使用瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢測后，裝入干冰，送至上海美吉生物醫藥科技公司基于Illumina HiSeq第二代測序平臺測序。

1.3.3 生物信息學分析

首先使用TrimGalore v0.6.6（https：//github.com/Felix Krueger/TrimGalore）對從HiSeq測序平臺得到的雙端原始測序結果進行過濾，去掉低質量序列和接頭。然后將產生的高質量序列提交到QIIME v1.9.1平臺進行后續的生物信息學分析[8]：首先對雙端序列進行合并，對于合并后的序列，先去掉嵌合體序列[9]，然后使用UCLUST劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），閾值為97%[10]。基于核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP），使用最新版的RDP分類器對隨機抽取的代表性OTU序列進行注釋[11]。為比較兩個地區的微生物多樣性，使用QIIME平臺自帶腳本分別對鲊廣椒樣品的α與β多樣性進行分析及組間比較。基于OTU表和對應的序列，通過PICRUSt2對菌群功能進行預測[12]，并使用HUMAnN3對菌群代謝通路的豐度進行標準化處理。

1.3.4 統計分析

對收集到的恩施州利川市與恩施市鲊廣椒樣品的聚類分析使用R包Factoextra v4.2.2（https：//cran.r-project.org/web/packages/factoextra）進行。組間菌群差異比較使用置換多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PerMANOVA）多元方差分析法，具體使用R包pairwiseAdonis（https：//github.com/pmartinezarbizu/pairwiseAdonis）完成。通過PICRUSt2的菌群功能分析，使用STAMP v2.1.3進行統計檢驗與作圖[13]。組間門和屬相對含量差異分析使用威爾科克森符號秩檢驗（Wilcoxon test），使用R包ggpubr完成（https：//cran.r-project.org/web/packages/ggpubr/）。組間生物標志物的確定使用線性判別分析效應大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe），線性判別分析值（linear discriminant analysis，LDA）值設為3.0[14]。使用R軟件包ggplot（https：//github.com/tidyverse/ggplot2）或ggpubr進行作圖。

2 結果與分析

2.1 微生物多樣性分析

2.1.1 鲊廣椒菌群α多樣性分析

使用高通量測序技術，對恩施州不同地區來源的鲊廣椒進行了分析，經過去除低質量序列，去除序列標簽（barcode）和嵌合體序列后，共得到1 199 308條高質量序列。在此基礎上，對恩施鲊廣椒的微生物多樣性進行了分析。使用97%的閾值進行OTU聚類，結果共得到12 212個OTU。接下來使用RDP分類器對每個代表性OUT序列進行了注釋，共注釋到22個菌門，37個菌綱，73個菌目，146個菌科以及343個菌屬。分別對恩施州恩施市和利川市來源的鲊廣椒α多樣性進行了計算與統計分析，結果見圖1。

圖1 恩施州不同地區鲊廣椒樣品序列與微生物多樣性Fig.1 Sequence number and microbial diversity of Zha-chili samples from different regions in Enshi prefecture

由圖1可知，基于非參數的威爾科克森符號秩檢驗顯示，利川市來源的鲊廣椒辛普森多樣性指數顯著高于恩施市鲊廣椒樣品，而Chao1指數無顯著差異（P＞0.05），表明盡管利川市的各分類單元數量低于恩施市，但是利川市的微生物多樣性高于恩施市，而豐富度無顯著差異（P＞0.05）。總體上，來自恩施市的鲊廣椒各個分類單元數量多與利川市，但是無顯著差異（P＞0.05）。

2.1.2 鲊廣椒菌群主坐標分析

比較了采集自恩施州兩個地區的鲊廣椒樣品的β多樣性，結果見圖2。

圖2 恩施州不同地區鲊廣椒樣品聚類分析Fig.2 Cluster analysis of Zha-chili samples from different regions in Enshi prefecture

由圖2聚類分析結果表明，多數采集自恩施市的鲊廣椒能聚集在一起，另外兩個采集自恩施市的鲊廣椒樣品與利川市的鲊廣椒樣品聚集在一起，形成兩個大的分支。另外，還通過vegan包對鲊廣椒的樣品進行了主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）分析，結果見圖3。

圖3 恩施州不同地區鲊廣椒樣品β多樣性分析Fig.3 β diversity analysis Zha-chili samples from different regions in Enshi prefecture

由圖3可知，基于歐式距離的PCoA1和PCoA2總體上能解釋大約64%的菌群總體變量。實際上，采集自兩個地區的樣品，總體在PCoA1上差別較大。圖3PerMANOVA分析表明，兩個不同地區的鲊廣椒樣品菌群差異極顯著（P=0.001）。另外，采集自利川市來源的鲊廣椒樣品之間組內差異較小，而恩施市樣品組內差異較大，在PCoA1與PCoA2兩個方向上分布均較為分散。

2.2 鲊廣椒菌群物種組成分析

為進一步分析采集自恩施州兩個地區鲊廣椒的差異，從物種組成中提取出門和屬的信息進行統計分析，結果見圖4。本研究中，將相對含量＞1%的門或屬定義為優勢菌門或者優勢菌屬。

圖4 基于門（a）和屬（b）水平恩施州不同地區鲊廣椒樣品優勢微生物平均相對含量Fig.4 Average relative abundance of dominant microbe of Zha-chili samples from different regions in Enshi prefecture based on phylum(a) and genus(b) levels

由圖4a可知，在門的分類水平上，恩施州鲊廣椒共包含3個優勢菌門，它們分別是厚壁菌門（Firmicutes），變形菌門（Proteobacteria）和藍細菌門（Cyanobacteria）。值得注意的是，厚壁菌門在兩個地區的鲊廣椒中均占據絕對地位，相對含量均超過了85%。統計分析表明，恩施州兩個地區的鲊廣椒中含的3個優勢菌門在相對含量上均無顯著差異（P＞0.05）。

由圖4b可知，在屬的分類水平上，共檢測到10個優勢屬，分別是促生乳桿菌屬（Levilactobacillus）（43.20%），伴生乳桿菌屬（Companilactobacillus）（9.88%），乳桿菌屬（Lactobacillus）（8.54%），乳植物桿菌屬（Lactiplantibacillus）（7.38%），遲緩乳桿菌屬（Lentilactobacillus）（3.97%），魏斯氏菌屬（Weissella）（3.16%），鏈霉菌屬（Streptomyces）（1.97%），肇源腐敗乳桿菌屬（Loigolactobacillus）（1.51%），四聯球菌屬（Tetragenococcus）（1.30%）和聯合乳桿菌屬（Ligilactobacillus）（1.20%）。總體上，乳酸菌分別在利川市和恩施市來源的鲊廣椒中分別占到總的91.36%和74.07%。經過統計分析發現，有6個優勢屬在恩施州兩個地區的鲊廣椒中存在差異：采集自利川市的鲊廣椒中促生乳桿菌屬的相對含量顯著較高（P＜0.01），在利川市鲊廣椒的相對含量為78.88%，在恩施市的鲊廣椒中相對含量為23.99%；另外5個屬，即乳植物桿菌屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、肇源腐敗乳桿菌和鏈球菌屬在恩施市的鲊廣椒中相對含量較高（P＜0.05），在恩施市的鲊廣椒中含量分別為：10.96%，4.79%，10.10%，2.29%和2.51%，而在利川鲊廣椒中的相對含量為：0.72%，0.14%，5.63%，0.05%和0.96%。

恩施州鲊廣椒的多數優勢細菌屬，也出現在湖南懷化和貴州松桃鲊廣椒中，然而鏈霉菌屬是恩施州鲊廣椒中特有[4，15-17]。值得注意的是，鏈霉菌是多種生物活性代謝產物的主要來源[18-19]，可能對醡廣椒中有害菌具有抑制能力；同時，鏈霉菌能產生淀粉酶和脂肪酶，也可能對鲊廣椒的風味起到重要作用。另外，鲊廣椒在制作過程中，添加了食鹽，而據報道，具有較強鹽耐受能力的四聯球菌能增強食品的風味物質含量[20-21]，因此推測，四聯球菌與鲊廣椒的風味品質有關，而四聯球菌和鏈霉菌與鲊廣椒風味的關系，有待于進一步的實驗證實。

2.3 不同地區鲊廣椒菌群差異分析

為進一步分析兩個地區來源鲊廣椒中的生物標志物，使用LEfSe進一步基于OTU數據，對所有分類單元的差異情況進行分析，結果見圖5。

圖5 基于LEfSe分析的恩施州不同地區鲊廣椒菌群樣品生物標志物Fig.5 Biomarkers of Zha-chili samples flora from different regions in Enshi prefecture based on LEfSe analysis

由圖5可知，除了優勢屬促生乳桿菌屬（Levilactobacillus）之外，在利川市鲊廣椒中還富集有非優勢屬—黃單胞菌屬（Xanthomonas）和Terasakiispira。同樣的，在恩施市鲊廣椒中優勢屬魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、肇源腐敗乳桿菌屬（Loigolactobacillus）等以及3個非優勢屬：Aureimona，乳球菌屬（Lactococcus）和鏈球菌屬（Streptococcus）顯著富集。根據這些菌屬在LEfSe分析中得到的LDA值大小，可以將促生乳桿菌屬（Levilactobacil lus）和魏斯氏菌屬（Weissella）分別作為利川市和恩施市鲊廣椒的生物標志物。另一項研究顯示，促生乳桿菌與鲊廣椒的特征風味酸味呈正相關，而與苦味的回味（異味）呈負相關，說明了該菌在鲊廣椒的滋味中的作用。

2.4 恩施州鲊廣椒優勢屬相關性分析

自然發酵環境中微生物菌落結構較為復雜，有些不同微生物間存在相互促進作用，另一些可能存在拮抗作用。為分析鲊廣椒中微生物菌群間的相互作用關系，基于優勢屬相對含量，分析了它們的相關性，結果見圖6。

圖6 恩施州不同地區鲊廣椒樣品基于優勢菌屬相對豐度的菌群相關性分析Fig.6 Correlation analysis of bacterial community of Zha-chili samples from different regions in Enshi prefecture based on relative abundance of dominant genera

由圖6可知，在利川市與恩施市鲊廣椒的10個優勢屬中，僅聯合乳桿菌屬和鏈霉菌屬呈顯著正相關關系（P＜0.05），其他菌屬間相關性均不顯著（P＞0.05）。可能這兩個屬之間的微生物能合成對彼此生長有益的代謝物。研究顯示，鏈霉菌能產生一系列的生物活性物質（如guadinomine B）以及鐵載體、抗生素來抑制一些有害微生物；同時鏈霉素還能產生酯酶、淀粉酶和蛋白酶，將生物大分子降解成小分子化合物[22]，這些小分子化合物可能對聯合乳桿菌的生長有益。另外，乳酸菌可合成短鏈脂肪酸、氨基酸、維生素等[23]，推測這些物質可能促進了鏈霉菌的生長，因此導致這兩類微生物存在正相關關系。

2.5 菌群功能預測

使用PICRUSt2對恩施鲊廣椒樣品的菌群的功能進行了分析，獲得了各樣品基于京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）的代謝通路豐度。然后，提取菌群代謝途徑中豐度最高的15個代謝途徑，進行統計分析，結果見圖7。

圖7 恩施州不同地區鲊廣椒樣品菌群功能分析Fig.7 Functional analysis of Zha-chili samples flora from different regions in Enshi prefecture

由圖7可知，菌群豐度最高的15個代謝途徑分別為：L-1,2-丙二醇降解途徑，II型UDP-N-乙酰胞壁酰五肽生物合成途徑，II型肽聚糖生物合成途徑等。在這些代謝途徑中，有4條代謝途徑與核酸代謝有關，5條代謝途徑與碳水化合物有關，還有一些與細菌細胞壁有關。微生物多樣性分析顯示，恩施地區鲊廣椒中乳酸菌相對含量占絕對優勢；同樣的，菌群功能分析檢測到異型乳酸發酵代謝途徑，且相對豐度較高，這可能是鲊廣椒中富含乳酸的原因[3]。除了異型乳酸發酵途徑外，還檢測到了雙歧途徑，該途徑產物中也有乙酸和乳酸[24]。另外，在這些代謝途徑中，兩個地區間鲊廣椒差異最大的是L-1,2-丙二醇降解途徑，該途徑能為微生物的生命活動提供三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和還原力，而一些乳酸菌也能代謝L-1,2-丙二醇[25]。在這些豐度最高的代謝途徑中，有多個代謝途徑與鲊廣椒滋味物質合成有關，如乳酸、核苷酸和丙二醇分別與食品的酸味，鮮味和甜味有關。另外，恩施市與利川市鲊廣椒的菌群具有差異，但是預測的代謝途徑多數無顯著差異（P＞0.05），而這可以從微生物菌群中的功能冗余性來解釋[26]。

3 結論

從恩施州利川市與恩施市采集的鲊廣椒樣品中共有優勢屬有促生乳桿菌屬、伴生乳桿菌屬、乳桿菌屬等，其中的乳酸菌占據絕對優勢，乳酸菌中的促生乳桿菌屬的平均相對含量超過總體的40%。統計分析表明，利川市和恩施市的鲊廣椒在菌群組成上具有顯著差異，優勢屬中有6個優勢屬的相對含量具有顯著差異（P＜0.05）。基于LEfSe分析發現，伴生乳桿菌屬和魏斯氏菌屬在恩施市與利川市的鲊廣椒中相對含量差異最大，能分別將它們作為利川市和恩施市的生物標志物，來區分這兩個地區的鲊廣椒。菌群功能分析發現，與核苷酸和碳水化合物代謝與脂肪代謝的途徑豐度較高，而地區間多數豐度較高的代謝途徑豐度無顯著差異。