響應面法優(yōu)化米奶酒發(fā)酵條件研究

朱正軍，繆佳成，徐 爽，夏 燕，沈 艷，汪江波，徐 健*

（1.湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院 工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省工業(yè)微生物重點實驗室 發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.湖北琪譜檢測技術(shù)有限公司，湖北 武漢 430068；3.浙江興業(yè)集團有限公司，浙江 舟山 316100）

奶酒是一種歷史悠久的發(fā)酵酒，主要流行于我國的蒙古族地區(qū)以及東歐和中亞部分地區(qū)。傳統(tǒng)奶酒，根據(jù)其所用發(fā)酵劑的形態(tài)、原料乳類型的不同可分為開菲爾（Kefir）和酸馬奶（Koumiss）兩大類[1]。奶酒傳統(tǒng)上所用的原料一般是馬奶，但由于馬奶產(chǎn)量較低的問題，目前也有大量用羊奶和牛奶制成的奶酒[2]。研究發(fā)現(xiàn)，奶酒富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，還擁有預防心血管疾病、調(diào)節(jié)消化道活動、防止便秘、改善腎功能、降低血液膽固醇水平的功能[3]。由于這些有益的特點，奶酒如今在歐洲等地受到了越來越多的關(guān)注，然而，由于奶酒的風味特殊、酸度過高等特點，奶酒并不易被大眾所接受，所以近來研究者們?yōu)榱藢崿F(xiàn)奶酒風味和品質(zhì)的提升，嘗試向奶酒中添加桃花、葡萄汁等輔料，開發(fā)了諸多新型的奶酒[4-5]。

米酒是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵飲料，其原料主要是糯米，通過蒸煮、接種米酒曲、糖化發(fā)酵等工序加工而成。米酒作為一種低酒精度飲料，因為其良好的風味深受我國消費者的喜愛[6]。米酒具有很高的營養(yǎng)保健功能，米酒中的蛋白質(zhì)主要以多肽和氨基酸的形式存在，具有抗菌、保護肝腎功能、降低血壓及血脂等功能，對人體生長發(fā)育也起著重要的作用[7]。米酒還含有大量有機酸，如乙酸、檸檬酸、琥珀酸等，這些有機酸在促進腸道消化吸收、緩解疲勞等保健功能方面有重大的意義[8]。除此之外，米酒中還含有豐富的維生素、無機鹽、酚類物質(zhì)、多肽、多糖和一些能夠促進人體生長發(fā)育、預防疾病的微量元素[9-10]。米酒在乳制品中的應用由來已久，早在清朝時期，我國北方就有用糯米酒作為凝乳劑制作扣碗酪的傳統(tǒng)，扣碗酪又稱傳統(tǒng)中式奶酪，這種奶酪口感爽嫩，兼具米酒的酒香和牛乳的奶香[11]。

本研究以糯米和脫脂奶粉為原料，研制出一款將奶酒與米酒特點結(jié)合在一起的新型發(fā)酵酒，與傳統(tǒng)奶酒相比，其風味更加豐滿協(xié)調(diào)，兼具奶香與米酒香且口感更加柔和，更加符合大眾口味，與傳統(tǒng)米酒相比，其蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)更加豐富。通過單因素試驗考察各因素對米奶酒品質(zhì)的影響，另通過響應面優(yōu)化其發(fā)酵條件，以期開發(fā)出一款口感豐富協(xié)調(diào)且兼具健康營養(yǎng)價值的新型發(fā)酵酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米（珍珠糯米，質(zhì)量等級為一級）、脫脂奶粉：市售；乳酸菌發(fā)酵劑（含保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）、釀酒活性干酵母、甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；試驗所用試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MJP-250恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏設備有限公司；SWCJ-IB（標準型）單人單面超凈工作臺：中國蘇州智凈凈化設備有限公司；JJ6000電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；DK-8D 恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司；YXQ-LS-75立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實驗有限公司醫(yī)療設備廠；PHS-3C pH計：上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米奶酒的制備流程及操作要點

糯米→蒸煮加曲發(fā)酵→米酒→稀釋→加入脫脂奶粉→滅菌→接種→發(fā)酵→滅菌→冷卻→成品

操作要點：

米酒的制備：挑選無霉爛糯米加水浸泡12 h后用清水洗凈、瀝水，常壓蒸煮20 min，用清水沖淋冷卻至米飯溫度28～32 ℃。拌入糯米質(zhì)量分數(shù)6‰的甜酒曲，攪拌均勻后于30 ℃發(fā)酵2 d。發(fā)酵完成后用紗布濾出酒液，并在室溫條件下8 000 r/min離心5 min，取上清液85 ℃水浴20 min滅菌，4 ℃條件下保藏備用。

稀釋、調(diào)配、滅菌：將米酒與水按一定體積比混合、稀釋，并添加一定量的脫脂奶粉，攪拌至完全融化。在85 ℃水浴滅菌20 min，并迅速冷卻至室溫。

接種、發(fā)酵：將適量乳酸菌菌粉加入由脫脂奶粉制成的100 g/L液體脫脂乳培養(yǎng)基中，混勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)基凝固后再以50 g/L的接種量于另一液體脫脂乳培養(yǎng)基中，如此反復傳代3～4次后，于4 ℃保藏備用；酵母菌活化：稱取原料質(zhì)量0.1%的活性干酵母溶于20 g/L的葡萄糖溶液中，38 ℃水浴20 min。將活化好的乳酸菌和酵母與冷卻至室溫的混合原料攪拌均勻，于30 ℃恒溫條件下發(fā)酵2.5 d。

滅菌、冷卻：發(fā)酵完成后38 ℃水浴20 min再次滅菌，冷卻至室溫即獲得米奶酒成品。

1.3.2 米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

以乳酸菌接種量6%，脫脂奶粉添加量7.5 g/100 mL，米酒添加量60%，發(fā)酵溫度30 ℃，酵母菌接種量0.1%為基礎條件，改變單一變量，分別考察不同乳酸菌接種量（2%、4%、6%、8%、10%），脫脂奶粉添加量（2.5 g/100 mL、5.0 g/100 mL、7.5g/100mL、10.0g/100mL、12.5g/100mL），米酒添加量（30%、40%、50%、60%、70%），發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）對米奶酒總酸、酒精度和感官評分的影響。

1.3.3 米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇脫脂奶粉添加量（A）、米酒添加量（B）和乳酸菌接種量（C）為3個影響因素，以米奶酒感官評分（Y）為響應值，設計3因素3水平響應面試驗，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization of rice-milk wine

1.3.4 測定方法

酒精度：參考GB 5009.225—2023《酒和食用酒精中乙醇濃度的測定》的酒精計法測定[12]；總糖、總酸和氨基酸態(tài)氮：參考GB/T 23546—2009《奶酒》的方法進行[13]。

米奶酒的感官評價方法參照中華人民共和國國家標準GB/T 23546—2009《奶酒》中發(fā)酵型奶酒的評價細則，并結(jié)合米奶酒的酒體特點經(jīng)過些許改動后進行，取約25 mL酒樣于潔凈干燥的品酒杯中進行評價。評定小組由10人（男女各5人）組成，且皆具有酒體感官評價經(jīng)驗。主要從色澤（10分）、氣味（30分）、滋味（40分）、典型性（20分）四個方面依次對成品進行評分，總分為100分，米奶酒的感官評分標準見表2。

表2 米奶酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of rice-milk wine

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

本研究中所有試驗和檢測均重復進行3次，數(shù)值以“平均值±標準差”表示。采用IBM SPSS 25.0版統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，P＜0.05認為數(shù)值間存在顯著性差異。使用Origin 2021b軟件進行數(shù)據(jù)繪圖。使用Design Expert V13軟件進行響應面試驗設計和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 乳酸菌接種量對米奶酒發(fā)酵的影響

由圖1可知，隨著乳酸菌接種量的增加，米奶酒的總酸升高，酒精度降低，感官評分呈先升高后降低的趨勢。乳酸菌接種量為8%時，米奶酒的感官評分最高，為82分。這可能是由于乳酸菌接種量的增大使得米奶酒發(fā)酵體系中乳酸菌活菌數(shù)上升，乳酸菌發(fā)酵過程中累積產(chǎn)酸量也不斷增加[14]。而發(fā)酵體系總酸含量過高以及酵母菌和乳酸菌的生存競爭，可能會導致酵母的生長發(fā)酵受到抑制，從而使成品的酒精度下降。乳酸菌發(fā)酵過快、產(chǎn)酸過多也會對感官評分產(chǎn)生影響，總酸過高會使成品產(chǎn)生苦澀味，導致成品品質(zhì)下降[15-16]。因此確定米奶酒乳酸菌最佳接種量為8%。

圖1 乳酸菌接種量對米奶酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus inoculum on the quality of rice-milk wine

2.1.2 米酒添加量對米奶酒發(fā)酵的影響

由圖2可知，隨著米酒添加量的增加，米奶酒的總酸略降低，酒精度及感官評分均呈先升高后降低的趨勢。米酒添加量為60%時，米奶酒的感官評分最高，為81.5分。米酒中含有大量的糖，測得試驗制備米酒總糖含量為413.1 g/L，酒精度為1.12%vol，這些糖是米奶酒中酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的主要碳源[17]。當米酒添加量＞60%時，糖含量過高可能會抑制酵母菌的生長使得酒精度下降[18]。因此確定米奶酒中最佳米酒添加量為60%。

2.1.3 脫脂奶粉添加量對米奶酒發(fā)酵的影響

由圖3可知，隨著脫脂奶粉添加量的增加，米奶酒的總酸降低，酒精度無顯著性變化，感官評分呈先升高后降低的趨勢。脫脂奶粉添加量為7.5 g/100 mL時，米奶酒的感官評分最高，為80分。這可能是由于隨著脫脂奶粉添加量的增加，發(fā)酵體系的水分活度降低，對乳酸菌的生長產(chǎn)生抑制作用，而酵母菌對低水分活度的耐受性較強，對其生長發(fā)酵影響較小[19]。當脫脂奶粉添加量較低時，米奶酒的感官評分也較低，這時米奶酒的奶味較淡且酸味過強。而當脫脂奶粉添加量過高時，酸味過低，口感單薄，且奶味掩蓋了酒香，使得米奶酒整體風味不夠協(xié)調(diào)。因此確定米奶酒中脫脂奶粉最佳添加量為7.5 g/100 mL。

圖3 脫脂奶粉添加量對米奶酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of skim milk powder addition on the quality of rice-milk wine

2.1.4 發(fā)酵溫度對米奶酒發(fā)酵的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，米奶酒的總酸升高，酒精度的變化不顯著，感官評分呈先升高后降低的趨勢。發(fā)酵溫度為30 ℃時，米奶酒的感官評分最高，為81.2分。這可能是由于本試驗所用的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的最適生長溫度為40～45 ℃，溫度越高越適宜嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的生長發(fā)酵，米奶酒的乳酸累積量也越高；發(fā)酵溫度越低，米奶酒中乳酸菌的生長發(fā)酵速率就越慢，乳酸積累量越低。但溫度過高又會加快酵母菌生長增殖，菌體過早進入衰亡期，不利于糖轉(zhuǎn)化為酒精，使得米奶酒的酒精度有所下降[20-21]。發(fā)酵溫度較低時乳酸菌發(fā)酵不充分，使得米奶酒酸味過低，感官評分下降。總酸過高時口感變澀，感官評分也降低。因此確定米奶酒的最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對米奶酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of rice-milk wine

2.2 米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗

米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗設計及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 米奶酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗設計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface methodology for fermentation conditions optimization of rice-milk wine

表4Table 4 Variance analysis of regression model

使用Design-Expert V13軟件對表3中數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得到以米奶酒感官評分（Y）為響應值，對脫脂奶粉添加量（A）、米酒添加量（B）和乳酸菌接種量（C）的多元二次回歸方程模型：

由表4可知，失擬項P值0.235 0＞0.05，不顯著，模型的F值為251.83，P值＜0.000 1，極顯著，表明該模型的回歸效果極顯著，可用于對本試驗中米奶酒的條件進行優(yōu)化。同時根據(jù)P值和F值的大小可以判斷各因素對米奶酒感官評分的影響大小[22]，一次項A、B，交互項AB、BC，二次項B2、C2對米奶酒的感官評分均有極顯著影響（P＜0.01）。一次項C，二次項A2對米奶酒的感官評分均有顯著影響（P＜0.05）。交互項AC對米奶酒的感官評分無顯著影響（P＞0.05）。由F值可知，各因素對米奶酒感官評分影響順序由大到小為：米酒添加量（B）＞脫脂奶粉添加量（A）＞乳酸菌接種量（C）。

2.3 各因素響應面交互作用分析

為更直觀的分析各因素之間的交互作用對米奶酒感官評分的影響，根據(jù)表3和表4的結(jié)果使用Design Expert V13繪制三維圖，結(jié)果見圖5。

圖5 各因素間交互作用對米奶酒感官評分影響的響應曲面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of the interaction of various factors on sensory score of rice-milk wine

由圖5可知，響應曲面坡度越陡，其等高線也就越接近于一個橢圓，這說明這兩個因素間對米奶酒的感官評分作用越顯著，反之若等高線呈圓形則表示兩因素交互作用不顯著[23-25]。從圖5A可以看出，脫脂奶粉添加量和米酒添加量的響應面圖坡度最陡，等高線呈明顯的橢圓形，這表明這兩個因素的交互作用對米奶酒的感官評分的影響最顯著，隨著米酒添加量的增加，米奶酒的感官評分呈現(xiàn)先增長后逐漸減少的趨勢，在米酒添加量為59%～67%時，米奶酒的感官評分較高。由圖5B可知，脫脂奶粉添加量和乳酸菌接種量的響應面圖坡度較緩，這表示這兩個因素之間的交互作用對米奶酒的感官評分則沒有顯著的影響，而米酒添加量和乳酸菌接種量的等高線圖（圖5C）也呈一個橢圓，乳酸菌接種量固定不變，米奶酒的感官評分隨米酒添加量的增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；米酒添加量不變，米奶酒的感官評分隨乳酸菌接種量的增加先增大后明顯減小，兩因素對感官評分的影響呈顯著正交互作用，上述三維圖呈現(xiàn)結(jié)果與表4方差分析結(jié)果一致。

通過Design-Expert V13軟件對數(shù)據(jù)進行分析后得到米奶酒的最佳發(fā)酵條件為：脫脂奶粉添加量8.92 g/100 mL、米酒添加量63.27%、乳酸菌接種量9.24%，此條件下米奶酒預測感官評分為81.8分。為了試驗實際可操作性，將最佳條件參數(shù)調(diào)整為脫脂奶粉添加量9.0 g/100 mL、米酒添加量63.0%、乳酸菌接種量9.0%。按照調(diào)整后的條件進行驗證試驗，得到米奶酒感官評分實際值為82.3分，接近于預測值，證明模型擬合性好，表明結(jié)果有效。

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量指標

按照優(yōu)化后條件制出的米奶酒感官評分為82.3分，呈乳白微黃，色澤均勻，有光澤。味道奶香濃郁，兼具米酒香和發(fā)酵乳香，口感上奶香與酒味協(xié)調(diào)，酸甜協(xié)調(diào)，酒體豐滿，醇厚協(xié)調(diào)。由表5可知最佳條件下米奶酒酒精度為9.03%vol，總酸為5.07 g/L，總糖為82.10 g/L，氨基酸態(tài)氮為0.52 g/L，符合國標GB/T 23546—2009《奶酒》對發(fā)酵型奶酒的理化要求。

表5 奶酒標準及米奶酒質(zhì)量指標Table 5 National standard for milk wine and quality indexes of rice-milk wine

3 結(jié)論

本研究以糯米和脫脂奶粉為原料，使用乳酸菌和酵母菌作為發(fā)酵劑進行米奶酒發(fā)酵。在單因素試驗的基礎上以感官評分為響應值進行響應面試驗對米奶酒的條件進行優(yōu)化，得到米奶酒的最佳發(fā)酵條件為：脫脂奶粉添加量為9.0 g/100 mL、米酒添加量63.0%、乳酸菌接種量9.0%。在此條件下發(fā)酵出的米奶酒感官評分為82.3分，風味豐滿協(xié)調(diào)，兼具發(fā)酵乳香與米酒香，是一款口感細膩柔和且兼具健康營養(yǎng)價值的新型發(fā)酵酒，為我國米酒的加工應用和新型奶酒的研發(fā)提供了新的方向。