橄欖果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

王 宏，黃炳旗，劉功良，肖更生，趙文紅，李學(xué)莉，白衛(wèi)東*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院 廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225；2.東鵬飲料（集團(tuán)）股份有限公司，廣東 深圳 518055）

橄欖（Canarium album），又稱青果，是橄欖科橄欖屬植物，主要分布在廣東、福建、廣西等省，具有悠久的食用和藥用歷史。橄欖富含多酚、類黃酮、膳食纖維、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，具有抗氧化[1]、抗神經(jīng)炎癥[2]、調(diào)節(jié)腸道微生物[3]、防止肥胖癥[4]等多種生物活性，逐漸受到食品、醫(yī)藥和保健行業(yè)的重視，已被我國衛(wèi)生健康委員會(huì)列入藥食同源目錄[5]。目前，橄欖產(chǎn)業(yè)存在科技創(chuàng)新不足、采后商品化和深加工滯后、市場開發(fā)不足、品牌建設(shè)乏力等問題[6]，不利于橄欖產(chǎn)業(yè)的精深加工開發(fā)和全面發(fā)展。使用有效的加工技術(shù)和方法對橄欖進(jìn)行加工，在保留橄欖果的營養(yǎng)價(jià)值的同時(shí)，又能改善產(chǎn)品的功能特性，提升橄欖的加工利用價(jià)值，是橄欖加工產(chǎn)業(yè)的新熱點(diǎn)。

橄欖除了鮮食之外，還可制作成果汁飲料[7-8]、果醋[9]、果酒[10-11]等形式在市場進(jìn)行銷售。其中，果酒可以極大地保留果實(shí)中原有的營養(yǎng)物質(zhì)，具有多種生理活性[12]。因此，利用橄欖果實(shí)通過發(fā)酵生產(chǎn)橄欖果酒，不僅能有效保留果實(shí)中原有的營養(yǎng)物質(zhì)[13]，而且豐富并增加了其他營養(yǎng)成分及保健功能[14]。對橄欖果酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，極大地保留橄欖中的多酚類物質(zhì)、維生素C等生物活性成分[15-18]，同時(shí)對其特征成分和風(fēng)味進(jìn)行分析，開發(fā)一款符合大眾口味的低醇度高營養(yǎng)價(jià)值的橄欖果酒，一方面可以為橄欖果酒的研究提供理論基礎(chǔ)，另一方面可以為橄欖果酒的加工生產(chǎn)及應(yīng)用提供新的指導(dǎo)方向。

本研究以橄欖果為原料，研制橄欖發(fā)酵型果酒。首先篩選出橄欖果酒最適發(fā)酵菌種，再通過單因素和正交試驗(yàn)對橄欖果酒的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對最優(yōu)工藝下的橄欖果酒中多酚、維生素C、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等特征成分進(jìn)行分析，以期為橄欖果酒的開發(fā)與利用提供理論參考，也為橄欖果酒的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖果（廣東檀香1號）：購自潮州市文祠鎮(zhèn)；食用小蘇打、白砂糖：市售；EX-V果膠酶（活性和廣譜邊緣酶活性）、DV10酵母：法國拉曼集團(tuán)；SY酵母、BA酵母、RV171酵母、BV818酵母：安琪酵母股份有限公司；偏重亞硫酸鉀、氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、酚酞指示液（10 g/L）、福林酚、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品、二氯靛酚、葡萄糖（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸、氯化鈉、碳酸氫鈉（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6同步攪拌水浴鍋：上海赫田科學(xué)儀器有限公司；BSP生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZQZY-98CES培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；P901酸度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；SOP電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；LB50T糖度計(jì)：廣州速為電子科技有限公司；5977B-8890氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 橄欖果酒發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

橄欖果挑選→橄欖前處理（洗滌、去核、破碎）→調(diào)整成分→菌種活化→控溫發(fā)酵→滅菌→過濾→橄欖果酒

橄欖果挑選：挑選表皮完整、無破損、呈鮮綠或者淡綠色的橄欖果。

橄欖前處理：將橄欖洗凈放入容器內(nèi)，按照一定的料液比添加水，將橄欖破碎到一定程度后，迅速轉(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶中。

調(diào)整成分：分別加入橄欖與水總質(zhì)量（或果漿總質(zhì)量）0.02%的C-MAX果膠酶和0.02%的偏重亞硫酸鉀，使用白砂糖調(diào)整發(fā)酵液糖度為33°Bx，充分?jǐn)嚢瑁褂眯√K打?qū)⒋l(fā)酵液初始pH調(diào)節(jié)至4.5。

菌種活化、控溫發(fā)酵：將DV10酵母和水按照比例1∶10（g∶mL）進(jìn)行混合，37 ℃活化15 min。再按照一定接種量接種到橄欖果漿中，使用封口膜進(jìn)行密封，放入恒溫培養(yǎng)箱中在一定溫度條件下進(jìn)行發(fā)酵，使用糖度計(jì)對糖度變化進(jìn)行監(jiān)測，待橄欖果酒中糖度不再下降時(shí)，即認(rèn)為橄欖果酒發(fā)酵結(jié)束。

滅菌、過濾：將發(fā)酵好的橄欖果酒75 ℃滅菌5 min，把滅菌好的橄欖果酒使用3～4層121 ℃滅菌15 min后的紗布過濾，收集濾液至錐形瓶中，使用封口膜進(jìn)行密封，4 ℃冰箱中冷藏。

1.3.2 最優(yōu)菌種的篩選

選取BV818、SY、DV10 3種酵母作為考察菌種，控制橄欖果破碎程度為90%，料液比為1∶4（g∶mL），3種酵母添加量為0.05%，發(fā)酵液糖度為33°Bx，發(fā)酵溫度24 ℃。通過基礎(chǔ)工藝條件制作橄欖果酒，并記錄發(fā)酵過程中的糖度變化、酒精度和感官評分。

1.3.3 橄欖果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

設(shè)定橄欖果破碎程度為90%，料液比為1∶4（g∶mL），發(fā)酵溫度24 ℃為基礎(chǔ)條件，改變單一條件，以橄欖果酒酒精度和感官評分作為評價(jià)指標(biāo)，分別考察破碎程度（0、30%（顆粒大小為10 mm×5 mm）、60%（5 mm×2 mm）、90%（＜1 mm×1 mm）），料液比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g∶mL）），發(fā)酵溫度（16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃）對橄欖果酒發(fā)酵的影響。

1.3.4 橄欖果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以橄欖果破碎程度（A）、料液比（B）、發(fā)酵溫度（C）為因素，以橄欖果酒酒精度和感官評分為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 橄欖果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation process optimization of olive wine

1.3.5 測定方法

（1）感官評價(jià)

選擇10位經(jīng)過培訓(xùn)并具備食品專業(yè)知識(shí)的感官評價(jià)人員，從外觀、香氣、口感和典型性4個(gè)方面對橄欖果酒進(jìn)行感官評分，取10人平均分，滿分為100分。感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 橄欖果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of olive wine

（2）理化指標(biāo)測定

糖度：采用糖度計(jì)法；酒精度、總酸、還原糖、維生素C：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計(jì)法、電位滴定法、直接滴定法和2,6-二氯靛酚滴定法；總酚：采用福林酚法[19]并稍作修改，福林酚試劑添加量為1 mL，10%碳酸鈉與福林酚用量比例為3∶1，反應(yīng)時(shí)間為30 min。

（3）揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（headspacesolid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）測定橄欖果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。將萃取針（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）于250 ℃條件下活化10min，備用。吸取7 mL發(fā)酵液于15 mL樣品瓶中，加入NaCl 1.4 g和磁力轉(zhuǎn)子，蓋上鋁蓋；然后將樣品置于磁力攪拌加熱器上，45 ℃預(yù)熱5 min；插入已活化的萃取針，吸附萃取50 min；隨即將萃取針插入GC-MS儀器進(jìn)樣口中，250 ℃解吸5 min。

GC條件：采用DB-WAX UI色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣模式為不分流，以高純氦氣（He）作為載氣。柱溫箱升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升溫至100 ℃，保持10 min；以10 ℃/min升溫至200 ℃，保持10 min。

MS 條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；采集模式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍50～550 m/z。

定性定量方法：選取匹配度≥70%的物質(zhì)，通過美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）14譜庫與揮發(fā)性化合物譜圖進(jìn)行比對，結(jié)合相關(guān)資料及文獻(xiàn)進(jìn)行分析和鑒定進(jìn)行定性；采用面積歸一法進(jìn)行定量[20]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（n=3）的形式表示。采用JMP13進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌種類型對橄欖果酒發(fā)酵的影響

酵母菌菌種類型對橄欖果酒發(fā)酵的影響見表3。由表3可知，3種酵母菌發(fā)酵制備的橄欖果酒酒精度及殘?zhí)蔷螱B/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中規(guī)定的范圍；DV10酵母發(fā)酵制備的橄欖果酒感官評分最高（74.53分）且較另外兩種酵母發(fā)酵周期縮短，表現(xiàn)出最高的活性，因此后續(xù)試驗(yàn)將選用DV10酵母發(fā)酵橄欖果酒。

表3 酵母菌種類型對橄欖果酒發(fā)酵的影響Table 3 Effect of yeast type on the fermentation of olive wine

2.2 橄欖果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 破碎程度對橄欖果酒發(fā)酵的影響

由圖1可知，隨著橄欖果破碎程度的提高，橄欖果酒酒精度、感官評分均呈先上升后趨于平緩的趨勢。橄欖果破碎程度為90%時(shí)，橄欖果酒的酒精度、感官評分均最高，分別（13.43±0.47）%vol和（62.67±1.53）分。可能是因?yàn)楫?dāng)橄欖果為破碎程度為90%時(shí)，橄欖果肉中的風(fēng)味物質(zhì)更容易析出到酒體中，豐富了橄欖果酒的風(fēng)味成分，從而提高了橄欖果酒的感官效果。因此選擇橄欖果的最佳破碎程度為90%。

圖1 破碎程度對橄欖果酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of crushing degree on the quality of olive wine

2.2.2 料液比對橄欖果酒發(fā)酵的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，橄欖果酒酒精度、感官評分均呈先下降后上升再下降的趨勢。當(dāng)料液比為1∶4（g∶mL）時(shí)，橄欖果酒的酒精度、感官評分均達(dá)到最高，分別為（16.00±0.17）%vol、（75.60±2.31）分；在料液比為1∶2～1∶4（g∶mL）時(shí)，隨著果肉的減少，橄欖果肉本身的澀味減少，果香味趨于合適，使得果酒口感得到提升，因此感官評分呈上升趨勢；料液比在1∶4（g∶mL）之后，隨著果肉減少，橄欖果本身的特殊風(fēng)味被淡化，影響橄欖果酒的整體風(fēng)味，使得感官評分下降；當(dāng)料液比為1∶6（g∶mL）時(shí)，感官評分呈現(xiàn)出一定的上升趨勢，但該料液比下的橄欖特征風(fēng)味淡薄，酒香掩蓋了果香，無果酒本身的清爽口感。因此選擇最佳料液比為1∶4（g∶mL）。

圖2 料液比對橄欖果酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of solid and liquid ratio on the quality of olive wine

2.2.3 發(fā)酵溫度對橄欖果酒發(fā)酵的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，橄欖果酒酒精度、感官評分均呈先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵溫度為24 ℃時(shí)，橄欖果酒的酒精度、感官評分均達(dá)到最高，分別為（15.13±0.64）%vol、（74.53±3.72）分；在發(fā)酵溫度為16～24 ℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，酒精度與感官評分都與溫度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，此時(shí)酵母在低溫下生長速度較慢，導(dǎo)致發(fā)酵不徹底，因此酒精度不高；當(dāng)溫度超過24 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，橄欖果酒的酒精度與感官評分都呈現(xiàn)快速下降的趨勢。綜上，認(rèn)為發(fā)酵溫度對橄欖果酒的發(fā)酵品質(zhì)具有較大的影響，最佳發(fā)酵溫度為24 ℃。

2.3 橄欖果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

由表4可知，在3種影響橄欖果酒發(fā)酵的因素中，按照各因素對感官評分的影響，從大到小依次是破碎程度（A）＞發(fā)酵溫度（C）＞料液比（B）。通過計(jì)算K值，可知最優(yōu)發(fā)酵工藝組合為A3B1C3，即橄欖果酒最優(yōu)工藝參數(shù)為破碎程度為90%、料液比為1∶3（g∶mL）、發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)及果酒品質(zhì)分析

為驗(yàn)證所得結(jié)果的正確性，在最優(yōu)工藝參數(shù)組合下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果表明，在最優(yōu)工藝下釀造的橄欖果酒感官評分為（91.83±0.67）分，具有較濃郁的橄欖果香與酒香，色澤金黃，清亮透明，口感圓潤醇厚、回味綿延。經(jīng)測定，橄欖果酒酒精度為（15.03±0.4）%vol，總酚含量為（27.76±0.36）g/L，總酸含量為（5.00±0.13）g/L，還原糖含量為（2.53±0.09）g/L，維生素C含量為（30.49±3.10）mg/L，符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求。

2.5 橄欖果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

通過HS-SPME-GC-MS測定橄欖果酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果見表5。由表5可知，從橄欖果酒中共檢測出38種揮發(fā)性物質(zhì)，包括9種醇類，相對含量為46.48%；酯類13種，相對含量為4.01%；醛類5種，相對含量為1.79%；酮類1種，相對含量為0.11%；酸類2種，相對含量為0.57%；酚類2種，相對含量為2.06%；烴類1種，相對含量為0.18%；烯烴類3種，相對含量為0.13%；萜烯1種，相對含量為0.32%；其他類型揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)1種，相對含量為0.15%。其中，橄欖果酒中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為醇類和酯類，共同構(gòu)成橄欖果酒特殊風(fēng)味的基礎(chǔ)[21-23]。

表5 橄欖果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果Table 5 Determination results of volatile flavor components in olive wine

醇類物質(zhì)為橄欖果酒中含量最高的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。這些醇類物質(zhì)可賦予橄欖果酒不同的香味，如苯乙醇能賦予橄欖果酒清甜的玫瑰花香、蜂蜜味與薔薇花香，能賦予橄欖果酒獨(dú)特的香氣，對酒的香氣形成具有積極作用[24-25]；異戊醇微甜帶苦，能賦予橄欖果酒獨(dú)特的苦杏仁味[26]；辛醇能賦予果酒茉莉與檸檬的香味[27]。各種高級醇相互協(xié)調(diào)，使得橄欖果酒的口感更加豐滿，豐富了橄欖果酒的酒香。

酯類物質(zhì)為橄欖果酒中種類最豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，這類物質(zhì)既呈香又呈味，是橄欖果酒中重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。本研究共檢測出13種酯類物質(zhì)，其中，乙酸乙酯的濃度最高，其次是辛酸乙酯。這些酯類物質(zhì)可賦予果酒不同香味，如辛酸乙酯可賦予橄欖果酒令人愉快的花果香氣及白蘭地酒香氣[28]；癸酸乙酯可賦予果酒李子花香和果香[29]。各種酯類物質(zhì)的香味相互協(xié)調(diào)、融合，豐富了橄欖果酒的風(fēng)味。

醛類、酚類、酮類和酸類物質(zhì)在橄欖果酒中的含量較少。其中，苯甲醛可賦予橄欖果酒櫻桃與堅(jiān)果香，這種物質(zhì)也同樣存在于白蘭地中，是重要的香氣物質(zhì)[30]；辛酸可賦予橄欖果酒草莓味、桃子味等多種果味。這些物質(zhì)對于橄欖果酒風(fēng)味的形成具有促進(jìn)作用，豐富了橄欖果酒整體的風(fēng)味。

3 結(jié)論

本研究以橄欖鮮果為原料，對橄欖果酒的工藝、品質(zhì)及風(fēng)味進(jìn)行探究，分析了酵母菌種、破碎程度、發(fā)酵溫度及料液比對橄欖果酒的影響，通過正交試驗(yàn)得到橄欖果酒最佳發(fā)酵工藝條件為破碎程度90%、料液比為1∶3（g∶mL）、發(fā)酵溫度為28 ℃。在最優(yōu)工藝條件下得到的橄欖果酒，感官評分為（91.83±0.67）分，色澤呈現(xiàn)出金黃色、清亮透明，果香與酒香協(xié)調(diào)，口感圓潤醇厚、回味綿延，具有橄欖的典型風(fēng)味。橄欖果酒中總酚含量為（27.76±0.36）g/L、總酸含量為（5.00±0.13）g/L、還原糖含量為（2.53±0.09）g/L、維生素C含量為（30.49±3.10）mg/L，共檢測出38種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，賦予了橄欖果酒特殊的果酒風(fēng)味。本研究在橄欖果酒發(fā)酵工藝參數(shù)方面具有一定的創(chuàng)新性和實(shí)用價(jià)值，研究結(jié)果為橄欖果酒的研發(fā)、加工與生產(chǎn)提供了新的指導(dǎo)方向，為橄欖精深加工產(chǎn)品開發(fā)提供思路。