川法小曲白酒鑒別方法的研究

陳燕梅，羅 玥，王新惠，鐘慈平，黃 萍，易 鑫，何 媛，徐躍成*

（1.成都大學 食品與生物工程學院，四川 成都 610106；2.四川省食品檢驗研究院，四川 成都 610100；3.國家市場監管重點實驗室（白酒監管技術），四川 成都 610100）

白酒是中國的國酒，在我國傳統文化和食品工業中有著舉足輕重的地位[1-2]。白酒釀造工藝獨特，按照生產工藝的不同分為固態法、液態法及固液法白酒、調香白酒。固態法白酒采用糧谷為原料、固態發酵、固態蒸餾的方式進行，賦予了其豐富的風味特征和較高的品質[3]。川法小曲白酒是固態法白酒的代表之一，廣泛分布在云貴川渝等地，香味成分具有量比關系，風格獨特[4]。固態法白酒的釀造工藝復雜，成本較高，而固液法白酒工藝較為簡單，且品質不如固態法白酒。因此存在部分商家為了牟利，將固液法白酒冒充傳統固態法白酒進行銷售的行為。這不僅損害了消費者和企業的切身利益，而且影響白酒市場的健康發展[5-6]。白酒中風味物質的含量和比例直接影響風味特征，是決定白酒品質的關鍵[7-8]。

隨著分析技術的發展，可獲得大量的數據，但數據之間的相關性高，處理起來比較困難[9]，這些冗余信息，對白酒的質量判別的準確性有一定的影響，因此需要利用多元統計分析方法對其中的有效信息進行挖掘[10]。多元統計分析是一種處理數據的有效手段，已廣泛應用于食品質量判定[11-13]。目前在白酒質量鑒別中常見的研究技術手段有色譜法[14]、質譜法[15]、同位素鑒別法[16]等方法。其中氣相色譜（gas chromatography，GC）法作為常規分析方法，操作簡單，成本較低，分析效率高，被廣泛應用于白酒行業[8]。張曉婕等[17]利用氣相色譜和氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對兩種工藝醬香白酒中揮發性物質進行了定性定量分析，結合香氣活性值和多元統計方法構建鑒別模型并得出糠醛可能是造成兩種工藝差異的重要物質。劉鴻鋼等[14]利用氣相色譜非靶向篩選11個變量結合主成分分（principal component analysis，PCA），分析了14批次白酒樣品，可明顯區分固態法白酒和液態法白酒。由于川法小曲白酒生產的規?；讲桓?，相關研究較少，制約著其發展。隨著經濟社會的發展，以質量為導向、以品牌為基礎的價值時代和“振興川酒”口號的提出，鑒別固態法川法小曲白酒質量勢在必行。因此，在對風味成分進行快速準確地測定分析的基礎上，結合多元統計分析方法，能有效的提取酒類的關鍵差異化合物，提高酒類鑒別的可靠性和準確性[18]。

該研究以川法小曲白酒為研究對象，采用氣相色譜直接進樣法對風味物質定性定量分析，利用風味物質定量結果，結合PCA和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）的方法，分析川法小曲白酒和固液酒中風味物質間的差異，為企業酒質的提升和白酒監管提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川法小曲白酒酒樣（固態法）21個（編號G1～G21）：由瀘州、眉山、南充、成都、江津等地酒企提供；以川法小曲白酒為基酒的酒樣（固液法）21個（編號GY22～GY42）：市售。

甲醇標準品：德國Dr.Ehrenstorfer Gmb H公司；乙酸正丁酯（色譜純）：貴州省計量測試院；正丙醇、仲丁醇、異丁醇、異戊醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯標準品：上海麥克林生化科技有限公司；乙酸乙酯標準品：成都市諾爾施科技有限責任公司；乙酸、丁酸、己酸乙酯、己酸標準品：北京曼哈格生物科技有限公司；丙酸乙酯、戊醇、庚二酸二乙酯、辛二酸二乙酯、壬二酸二乙酯標準品：廣州佳途科技股份有限公司；β-苯乙醇標準品：阿拉丁試劑（上海）有限公司；無水乙醇（色譜級）：成都市科隆化學品有限公司。以上標準品均為色譜純。

1.2 儀器與設備

島津GC-2010Plus氣相色譜儀[配有氫火焰離子化檢測器（hydrogen flame ionization detector，FID）]：島津（中國）有限公司；DB-624色譜柱（30 m×0.32 mm，1.80 μm）：安捷倫科技有限公司；XSE105型電子分析天平：梅特勒托利多科技（中國）有限公司；GenPure UV-TOC/UF×CAD plus型純水儀超純水系統：賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品溶液制備

19種單標溶液配制：準確稱取各標準品于10 mL容量瓶中，用體積分數60%的乙醇定容，配制成質量濃度為1 000 mg/L的單標溶液。

19種風味物質混合標準品溶液配制：準確稱19種風味物質標準品于100 mL容量瓶中，用體積分數為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻備用。

1.3.2 風味物質的檢測

樣品前處理：準確移取樣品1 mL于1.5 mL進樣小瓶中，加入10 μL內標使用液（乙酸正丁酯：1 7940 mg/L），混合均勻后直接進行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-624色譜柱（30m×0.32mm，1.80 μm）。升溫程序為：起始溫度33 ℃，保持8.8 min，以10 ℃/min升至60 ℃保持2 min，以8 ℃/min升至100 ℃保持1.5 min，以10 ℃/min升至220 ℃保持1 min，以25 ℃/min升至250℃保持8min；載氣為氮氣（N2），載氣流速為1.0mL/min，分流比10∶1，進樣量1.0μL，檢測器溫度280℃，進樣口溫度250℃。

定性方法：以19種單標溶液的保留時間為依據對19種風味物質的混合標準溶液進行定性[19]。

定量方法：分別準確吸取19種系列稀釋混合標準溶液于對應1.5 mL進樣小瓶中，用體積分數60%的乙醇溶液定容至1 mL，分別加入10 μL內標溶液，混合均勻后直接進行氣相色譜分析。以待測物與相應內標物的峰面積比（y）為縱坐標，質量濃度比（x）為橫坐標，建立各風味物質的標準曲線，采用內標法定量分析白酒中各風味物質含量。

1.3.3 方法學考察

內標標準曲線繪制與檢出限、定量限測定：不同濃度混標由低濃度到高濃度依次進樣分析，以信噪比（S/N）=3時所對應的標準物的質量濃度作為方法的檢出限（limit of detection，LOD），信噪比（S/N）=10時所對應的標準物的質量濃度作為方法的定量限（limit of quantification，LOQ）[20]。

加標回收率和精密度實驗[21]：根據白酒中各種化合物含量高低，分別準確稱取高、中、低三種質量濃度的19種混合標準溶液于10 mL容量瓶中，用白酒樣品定容。每個質量濃度平行測定6次，計算19種風味物質的平均加標回收率和精密度試驗結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4 川法小曲白酒鑒別分析

兩種不同工藝白酒的定量結果導入SIMCA 14.1統計分析軟件建立數據模型，基于PCA與OPLS-DA判別兩種工藝白酒的差異性。

1.3.5 數據分析

每個獨立實驗均進行3次平行試驗。風味物質定量結果以平行試驗后含量的算數平均值表示。使用軟件Excel 2019進行數據整理，將處理的數據矩陣導入SIMCA14.1軟件，進行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。

2 結果與分析

2.1 方法的標準曲線繪制、檢出限、定量限

各風味物質的保留時間、標準曲線回歸方程、線性范圍、相關系數（R2）及檢出限、定量限見表1。由表1可知，各風味物質的線性范圍為0.47～6 111.68 mg/L，標準曲線回歸方程相關系數（R2）均大于0.998，線性關系良好，檢出限為1.31～109.83 mg/L，定量限為2.36～338.38 mg/L，說明該方法靈敏度高，滿足白酒中風味物質分析方法要求。

表1 19種風味物質的保留時間、標準曲線回歸方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量限Table 1 Retention time, standard curve regression equation, linear range, correlation coefficient, detection limit and quantitative limit of 19 flavor substances

2.2 方法的加標回收率與精密度試驗

隨機抽取一個川法小曲白酒酒樣（G14）進行加標回收率和精密度試驗，試驗結果見表2。由表2可知，各物質在高、中、低加標濃度條件下的平均回收率為90.17%～112.57%，精密度試驗結果的RSD值為0.09%～4.77%，說明該方法的回收率較高，精密度良好，能滿足白酒中19種風味物質的檢測需求。

表2 白酒酒樣中19種風味物質的平均加標回收率和精密度試驗結果Table 2 Results of average recovery rates and precision tests of 19 flavor substances in Baijiu samples

2.3 川法小曲酒鑒別分析

2.3.1 兩種不同工藝白酒中風味物質定性定量分析

利用氣相色譜直接進樣法，對兩種工藝共42個白酒樣品中的風味物質進行定性定量分析，隨機選取一款川法小曲酒和固液酒樣的氣相色譜圖進行分析，結果見圖1。由圖1可知，兩種工藝白酒中共檢出16種風味物質，其中醇類8種，酯類5種，酸類3種，包括正丙醇、乙酸乙酯、乙酸等風味物質；且川法小曲白酒中檢出的風味物質的數量大于固液法白酒。

川法小曲白酒的風味物質含量具有以乙酸乙酯為主，高級醇含量較高的特點[4]。兩種酒樣中風味物質的定量結果見表3。由表3可知，川法小曲白酒中的乙酸乙酯（346.42～1 556.44 mg/L）、乳酸乙酯（61.22～1 509.78 mg/L）、異丁醇（217.1～509.86 mg/L）、異戊醇（379.51～1 091.06 mg/L）含量與楊建剛[22]報道的川法小曲白酒中的乙酸乙酯（417～2 088 mg/L）、乳酸乙酯（111.5～2 809 mg/L）、異丁醇（332.7～637.1 mg/L）、異戊醇（772.1～1 170.1 mg/L）質量濃度相似。表明本研究建立的方法定量結果準確可靠。醇類主要來源于發酵過程中微生物對原料中糖和氨基酸的分解代謝。對香氣起著重要的促進作用，也是形成其他類型揮發性化合物的前體[2]。川法小曲白酒中高級醇如正丙醇（175.69～6 829.04 mg/L）含量相較于固液酒中的正丙醇（53.98～411.62 mg/L）含量更高，但需要將其控制在一定范圍之內，以保持白酒的良好品質[23]。酯類物質也是白酒質量鑒定的重要指標，通過醇和酸的酯化反應形成[24]，乙酸乙酯和乳酸乙酯是小曲酒中的主要香氣特征成分[25]，且川法小曲白酒中乙酸乙酯（346.42～1 556.44 mg/L）和乳酸乙酯（61.22～1 509.78 mg/L）的含量稍高于固液酒中乙酸乙酯（523.4～1 455.46 mg/L）、乳酸乙酯（65.78～773.65 mg/L）的含量。川法小曲白酒發酵時間較短，酸類物質含量較高[4]，酸類化合物主要由微生物利用淀粉、脂肪、蛋白質等有機物發生生化反應生成[25]，對酒體的香氣有著重要的貢獻，川法小曲白酒中的乙酸（149.93～1 351.71 mg/L）、丁酸（0～532.02 mg/L）酸類物質含量稍高于固液酒的乙酸（270.61～706.23 mg/L）、丁酸（0～44.09 mg/L）。表明釀造工藝的不同使兩種工藝白酒含量特征具有差異，且川法小曲白酒的含量特征可作為區別其他工藝白酒的標識之一。

表3 酒樣中風味物質的定量結果Table 3 Quantitative results of flavor substances in Baijiu samples

酒樣中各類風味物質含量匯總結果見表4。由表4可知，川法小曲白酒酒樣中各類物質的平均含量及其平均總量均高于固液法酒樣，其中醇類＞酯類＞酸類。川法小曲白酒酒樣中的醇類平均含量與平均總量之比高于固液法酒樣，但酯類、酸類相反，說明兩種工藝白酒在風味物質含量及各類物質與總量的比例具有差異。

2.3.2 多元統計分析

為進一步發掘兩種工藝白酒的差異性，以風味物質含量作為因變量，不同工藝作為自變量，結合多元統計學方法對兩種酒樣進行分析。

（1）主成分分析

對兩種工藝白酒風味物質進行主成分分析，結果見圖2。

圖2 川法小曲白酒和固液法白酒風味成分主成分分析得分圖Fig.2 Score plots of principal component analysis of flavor substances in Sichuan Xiaoqu Baijiu and Baijiu produced with solid-liquid fermentation

由圖2可知，兩種工藝酒樣能夠效地區分開。因此采用PCA模型對川法小曲白酒和固液法白酒進行區分鑒別是可行的。

（2）正交偏最小二乘-判別分析

在PCA的基礎上進行OPLS-DA分析，結果見圖3。

圖3 川法小曲白酒和固液法白酒風味成分正交偏最小二乘-判別分析得分圖（A）、置換檢驗結果（B）及VIP值（C）Fig.3 Orthogonal partial least squares-discrimination analysis score plots (A), permutation test results (B) and VIP (C) of the flavor substances in Sichuan Xiaoqu Baijiu and Baijiu produced with solid-liquid fermentation

由圖3A可知，川法小曲白酒酒樣（G）和固液法酒樣（GY）分布于坐標軸不同區域，得到較好分離，說明兩種不同工藝酒樣存在差異性，可以實現兩種工藝酒樣樣品有效區分。本次分析中的自變量擬合指數（R2X）為0.843，因變量擬合指數（R2Y）為0.909，模型預測指數（Q2）為0.865，R2和Q2＞0.5表示模型擬合結果可接受[26]。由圖3B可知，經過200次置換檢驗，Q2回歸線與縱軸的相交點小于零，說明模型不存在過擬合，表明OPLS-DA模型穩定可靠，認為該結果可用于川法小曲白酒的鑒別分析。對OPLS-DA聚類結果中2組數據的差異性進行整體分析，得到變量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）預測值，VIP≥1可認為該變量為該判別模型的潛在差異物質，且VIP值越大說明該物質在判別過程中的貢獻越大[17]。由圖3C可知，得出3個具有統計學意義的差異物質分別為正丙醇、異戊醇、異丁醇（VIP值≥1），結果表明這3種成分可能是導致兩種工藝白酒差異的主要標志物。此結果與前文中定性和定量分析中結果相似，川法小曲白酒中醇類物質含量明顯高于固液法白酒。正丙醇、異戊醇、異丁醇在固態發酵中由微生物對原料中糖和氨基酸的分解代謝產生，而固液法工藝無法模擬出固態中這三種醇類的含量特點。

3 結論

本研究以川法小曲白酒和固液酒為對象，采用GC-FID結合內標法對酒樣中19種風味物質進行定量分析。該方法操作簡單，精密度及準確度良好，適用于白酒中19種風味物質的同時檢測。定量結果顯示，川法小曲酒樣中各類物質含量及總量均高于固液酒樣，且兩種工藝白酒的風味物質含量及各類物質與總量的比例具有明顯差異，說明白酒品質與各物質含量相關。采用OPLS-DA構建了川法小曲酒與固液酒樣的鑒別模型，模型良好可以實現兩種工藝酒樣的鑒別。通過VIP值（≥1）確定種工藝白酒之間的顯著性差異化合物為：正丙醇、異戊醇、異丁醇。

本研究利用氣相色譜分析技術結合多元統計分析模型對川法小曲白酒和固液酒進行鑒別，使兩種工藝酒樣的鑒別高效和客觀，并確定了對差異產生有較大貢獻的風味物質。川法小曲白酒和固液酒的準確鑒別可為白酒的質量控制提供一定技術參考。由于本研究所測的酒樣數量和風味物質種類有限，后期還需對大批量酒樣進行分析驗證并結合感官評定。使該方法能更有效、客觀地對白酒進行分類和鑒定。