三生調脂舒對糖尿病血糖波動大鼠Lp-PLA2活性表達的影響

丁 喆,李 軍,朱 燕,王柔鈞,季章龍,侯建婷,謝文皎

隨著我國步入老齡化社會及人民生活飲食方式的變化,糖尿病發生率逐年升高[1]。流行病學調查顯示,我國糖尿病病人已超過1億例,成為威脅我國人民生活健康的重要疾病[2]。糖尿病的主要死因并非血糖升高,而是由血糖升高帶來的一系列并發癥,這些并發癥需積極防治并抑制其進展,否則威脅病人生命[3]。相關研究顯示,通過積極地降低血糖對部分病人仍不能有效抑制并發癥進展,分析原因可能是由于血糖波動影響的[4]。糖尿病病人血糖波動幅度大,目前并無藥物控制血糖波動,因此,如何有效調節血糖的波動是目前的研究熱點。三生調脂舒是我院心血管內分泌科的多年經驗用方,已在臨床中得到較好應用,可治療高脂血癥、動脈硬化及糖尿病,特別是在調節血脂方面。前期實驗顯示,三生調脂舒具有多靶點調脂的功效[5]。三生調脂舒在糖尿病中的作用機制尚未明確。本研究構建了糖尿病血糖波動動物模型,以脂蛋白磷脂酶A2(lipoprotein phospholipase 2,Lp-PLA2)為核心指標觀察三生調脂舒對其的作用,使本藥用于糖尿病病人的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物、動物與材料

1.1.1 實驗藥物

三生調脂舒購自我院藥房[昆明市中醫醫院院內制劑,批號:滇藥制字(Z)20082311A],主要由制何首烏、三七、薏苡仁、山楂等構成,使用時沖泡即可,每克藥物相當于原生藥1.7 g。

1.1.2 實驗動物

雄性清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠90只,體質量180～220 g,所有大鼠均購自昆明醫科大學動物實驗中心[動物合格證號:SCXK(滇)K2020-0004],飼養于云南中醫藥大學動物實驗中心,由中央空調統一控制溫度和濕度,室溫20～26 ℃,濕度50%～60%,日常采用日光燈給予生活,12 h光暗循環。飼料和水均自由攝取。

1.1.3 實驗試劑

鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)(美國Sigma公司,貨號:V900890);胰島素(來源于豬胰腺)(江蘇萬邦生化醫藥公司,貨號:Y0001717);逸智型血糖儀和血糖試紙(德國羅氏公司);大鼠Lp-PLA2測定試劑盒(上海博湖生物科技有限公司,貨號:BH-R101083);C肽測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號分別為H391-1、A003-1-2和A001-3-2);白細胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)測定試劑盒、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)測定試劑盒和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)測定試劑盒(上海酶聯免疫生物科技公司,貨號分別為ml028513、ml102828和ml002859);三酰甘油(triacylglycerol,TG)測定試劑盒、總膽固醇(total cholesterol,TC)測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)測定試劑盒和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號分別為A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1和A113-1-1)。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病動物模型的建立

90只大鼠適應性喂養2周,2周后隨機選取10只作為正常組(Con組),其余80只參照文獻[6]方法建立糖尿病大鼠動物模型,給予腹腔注射1%STZ的檸檬酸緩沖液建立糖尿病大鼠模型(劑量為60 mg/kg,為準確比較,Con組大鼠給予注射不含有STZ的檸檬酸緩沖液)。注射48 h后,每日09:00～10:00尾靜脈采集大鼠血液監測血糖,當連續3 d血糖均≥16.7 mmol/L確認造模成功,對造模不成功的大鼠,于第4日注射STZ(30 mg/kg)再次造模,直到所有大鼠均造模成功為止。本研究共造模成功60只大鼠,造模過程中死亡20只。

1.2.2 血糖波動動物模型的建立

參照相關文獻[7]報道,造模成功大鼠再次適應性喂養2周,選取10只作為持續糖尿病高血糖組,其余50只構建血糖波動模型。波動模型的建立方法:每日08:00～08:30、14:00～14:30注射0.38 g/kg 50%葡萄糖溶液,注射30 min后,注射1次胰島素(根據血糖濃度調節胰島素的注射量,統計單位注射量4～12 U),上述血糖波動模型連續給藥6周(為保證結果具有可比性,持續高糖組及正常組腹腔注射等量生理鹽水),在造模過程中,死亡8只大鼠,最后剩余42只大鼠成功構建血糖波動模型。血糖波動模型構建的標準為6周后,測量9個時間點(08:00、09:00、10:00、11:00、12:00、15:00、16:00、17:00、18:00)的血糖,并繪制血糖變化趨勢曲線,從圖中可見血糖波動組血糖變化較大,證明造模成功。詳見圖1。

圖1 造模期不同時間血糖比較

1.2.3 動物分組

Con組10只,持續糖尿病高血糖組(Model-1組)10只,其余42只大鼠按照隨機數字表法分為糖尿病血糖波動對照組(Model-2組,12只)、三生調脂舒低劑量組(SSTZS-L組,10只),三生調脂舒中劑量組(SSTZS-M組,10只)及三生調脂舒高劑量組(SSTZS-H組,10只)。

1.2.4 藥物干預方法

干預時將三生調脂舒溶于蒸餾水,之后按照SSTZS-L組、SSTZS-M組和SSTZS-H組分別以0.5、1.0和2.0 g/(kg·d)三生調脂舒灌胃,Con組、Model-1組、Model-2組給予等體積的蒸餾水灌胃,干預時間為6周。6周的干預時間內,Model-1組死亡1只,Model-2組死亡4只,SSTZS-L組和SSTZS-H組各死亡1只,死亡原因均為糖尿病并發癥。最終Con組10只,Model-1組9只,Model-2組8只,SSTZS-L組9只,SSTZS-M組10只,SSTZS-H組9只進行數據分析。

1.2.5 血液和組織收集方法

1)血清收集:末次給藥結束后,分批將所有大鼠禁食12 h,于次日09:00腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉,麻醉后剖開腹腔,剪開胸隔膜,找到心尖處,收集大鼠血液,采用低溫高速離心機,4 ℃條件下,以3 000 r/min離心10 min后,收集上清液,2～8 ℃保存,進行相關生化指標檢測。2)腹主動脈收集:血液收集結束后,找出腹主動脈后取出,將其裁剪成2段,一段置于4%的多聚甲醛溶液中用于組織病理學,另一段置于超低溫冰箱中用于蛋白表達檢測。

1.3 觀察指標

1.3.1 血糖檢測方法

1)腹腔糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT):用藥結束后按照美國糖尿病并發癥動物模型協會制定的IPGTT操作[8]進行,實驗前1 d嚴格禁食但不禁水12 h,于次日將每只大鼠進行稱重,尾靜脈取血后,采用血糖試紙快速測定空腹血糖;配制25%的葡萄糖生理鹽水溶液,按照大鼠體重給予腹腔注射2.5 g/kg處理,注射后立即計時,分別于注射后0、30、60、120和180 min收集大鼠血液,采用血糖試紙對其進行血糖檢測并繪圖。2)血糖波動:平均血糖波動幅度(mean amplitude of glycemic excursions,MAGE)檢測參照文獻[9]報道方法:治療結束后,測體質量及1 d內測定4次隨機血糖。根據下列公式計算MAGE,MAGE=∑(λ/x),其中λ為每次血糖波動的最大值和最小值之差,x為有效波動的次數,ν為24 h平均血糖SD值。3)葡萄糖曲線下面積(area under curve of glucose,AUG):根據常規血糖檢測的IPGTT結果繪制血糖曲線圖,并計算AUG。AUG=(G0+G120)/2+G30+G60。

1.3.2 生化指標

Lp-PLA2、C肽、MDA、SOD、IL-1α、IL-6、TNF-α、TG、TC、HDL-C和LDL-C均根據試劑盒提供的說明書嚴格進行,結束后根據試劑盒提供的計算公式得到所測指標的數值。

1.3.3 組織病理學改變

采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察腹主動脈病理學改變,將腹主動脈從多聚甲醛溶液中取出,交由武漢塞維爾公司完成(按照常規方法,依次經脫水、切片及HE染色即可),返回切片后,采集圖像,每張圖片選取4個不同的視野。

1.3.4 相關蛋白表達

將腹主動脈從超低溫冰箱取出,研磨后采用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白,之后采用二喹啉甲酸(BCA)法對其進行定量并調平,上述完成后每組各取20 μg蛋白溶液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳完成后裁剪目的蛋白的凝膠,采用半干轉移法轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,之后采用5%的脫脂牛奶封閉2 h,洗滌3次。一抗封閉過夜,洗滌3次,二抗封閉30 min后,洗滌3次,完成后采用蛋白顯影系統將其顯影即完成。采用Image J計算各條帶灰度值,進行比較分析。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 大鼠一般情況觀察

所有大鼠適應性喂養期內均正常,飲食飲水良好,毛色光順發白,反應靈敏。糖尿病模型造模成功后,Con組無顯著變化,造模組大鼠表現為明顯消瘦、精神不振,毛發枯燥發黃且不順,反應遲鈍及動作遲緩。血糖波動模型構建成功后,基本情況和糖尿病模型構建成功后無明顯差異。給藥后上述情況有一定的好轉。

2.2 各組治療后IPGTT各時間血糖比較

記錄的5個時間點(0、30、60、120、180 min),與Con組比較,Model-1組、Model-2組及SSTZS各劑量組血糖均升高(P<0.05);SSTZS各劑量組低于Model-1組和Model-2組(P<0.05);30、60、120、180 min時,Model-2組血糖高于Model-1組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組治療后IPGTT各時間血糖比較(±s) 單位:mmol/L

2.3 各組大鼠血糖波動情況比較

與Con組比較,Model-1組、Model-2組及SSTZS各劑量組MAGE和AUG均升高(P<0.05);SSTZS各劑量組MAGE和AUG低于Model-1組和Model-2組(P<0.05);Model-2組MAGE和AUG高于Model-1組(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血糖波動情況比較(±s)

2.4 各組大鼠血脂指標比較

與Con組相比,Model-1組、Model-2組及SSTZS各劑量組TC、TG和LDL-C均升高(P<0.05),HDL-C降低(P<0.05);SSTZS各劑量組TC、TG和LDL-C低于Model-1組和Model-2組(P<0.05),HDL-C高于Model-1組和Model-2組(P<0.05);Model-2組TC、TG和LDL-C高于Model-1組(P<0.05),HDL-C低于Model-1組(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠血脂指標比較(±s) 單位:mmol/L

2.5 各組大鼠血清炎性因子含量比較

與Con組比較,Model-1組、Model-2組及SSTZS各劑量組炎性因子指標IL-1α、IL-6和TNF-α均升高(P<0.05);SSTZS各劑量組IL-1α、IL-6和TNF-α均低于Model-1組和Model-2組(P<0.05);Model-2組IL-1α、IL-6和TNF-α高于Model-1組(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠血清炎性因子比較(±s)

2.6 各組大鼠血清氧化和抗氧化應激指標比較

與Con組比較,Model-1組、Model-2組及SSTZS各劑量組MDA升高(P<0.05),SOD和C肽降低(P<0.05);SSTZS各劑量組MDA低于Model-1組和Model-2組(P<0.05),SOD和C肽高于Model-1組和Model-2組(P<0.05);Model-2組MDA高于Model-1組(P<0.05),SOD和C肽低于Model-1組(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠血清氧化和抗氧化因子比較(±s)

2.7 腹主動脈病理學改變

各組大鼠腹主動脈HE染色結果可見:Con組細胞排列整齊規則,血管壁纖維呈規則狀;Model-1組細胞核排列明顯紊亂,且血管內的纖維走向紊亂;Model-2組細胞核紊亂程度進一步加劇,同時纖維走向明顯散亂;與Model-1組和Model-2組比較,SSTZS各劑量組明顯好轉。詳見圖2。

圖2 各組大鼠腹主動脈血管改變(HE染色,×64)

2.8 各組大鼠血清、腹主動脈Lp-PLA2含量比較

與Con組比較,Model-1組、Model-2組及SSTZS各劑量組血清和腹主動脈Lp-PLA2表達升高(P<0.05);SSTZS各劑量組血清和腹主動脈Lp-PLA2表達低于Model-1組和Model-2組(P<0.05);Model-2組血清和腹主動脈Lp-PLA2表達高于Model-1組(P<0.05)。詳見圖3、表6。

表6 各組大鼠血清、腹主動脈Lp-PLA2含量比較(±s) 單位:μg/L

圖3 各組大鼠腹主動脈Lp-PLA2蛋白表達條帶圖(A為Con組;B為Model-1組;C為Model-2組;D為SSTZS-L組;E為SSTZS-M組;F為SSTZS-H組)

3 討 論

糖尿病歸屬于中醫學“消渴”范疇[10]。關于此病的描述最早見于《素問·奇病論》[11],書中將糖尿病描述為“脾癉”,核心為五氣之溢,“五味入口,藏于胃,脾則行之精氣,津液在脾中不能化則可至人口甘,此肥美所發地,此類人喜歡吃甜膩食品,長期以此則造成消渴”。三生調脂舒是我科研發的一種具有改善脂質代謝、抗氧化、抗炎癥反應的中藥制劑,已在臨床中應用超過15年,立意點為“調養脾腎、活血化瘀、化痰泄濁”,由三七、山楂、制何首烏、薏苡仁等組成,其中制何首烏為君,補腎益肝、化濁降脂;薏苡仁為臣,健脾滲濕、補中益氣;同時佐以生三七以實現行血活血、破瘀散結,佐以山楂以實現活血散瘀、化痰行氣。四味中藥共奏補肝益腎、活血化痰、疏肝健脾,標本兼顧、補脾益腎同時疏通氣滯、血瘀、痰阻等標實[12-14]。多數糖尿病病人均表現為脾腎不足、血瘀痰阻,三生調脂舒的立意和糖尿病的發生機制具有明顯的相關性。臨床和動物實驗研究表明,三生調脂舒對高脂血癥具有明顯的調節作用,可降低2型糖尿病病人超敏C-反應蛋白(hs-CRP)水平[15-16]。根據中醫“異病同治”的理論,結合前期研究工作,推測三生調脂舒可能對糖尿病血糖波動具有一定的作用,其作用機制可能與調節血管特異性炎癥標志物Lp-PLA2有關。

現代醫學認為,糖尿病是以血漿或血清葡萄糖升高為主要特點的一類代謝性疾病,引起血糖升高的主要因素為胰島素分泌缺陷或胰島素作用缺陷,降糖藥物可降低血糖,但部分病人不能較好地控制相關并發癥的進展[17-18]。血糖波動可能是造成糖尿病病人控制好血糖但并發癥仍然進展的原因[19]。血糖波動是指病人血糖水平在每日高峰和低谷之間變化不穩定的一種狀態,與胰島素功能、飲食、藥物及運動等密切相關,核心為胰島素水平分泌不足或胰島素效應不足造成的血糖波動有關[20]。為此,本研究構建了血糖波動動物模型,觀察三生調脂舒對其的作用,結果顯示,血糖波動的糖尿病大鼠模型相較于血糖穩定的大鼠模型具有高水平的血糖值和波動幅度,提示造模成功。另一方面間接說明血糖波動的糖尿病可能危害更大,采用三生調脂舒干預后,大鼠血糖和血糖波動指標MAGE和AUG均降低,表明三生調脂舒可改善糖尿病血糖波動大鼠血糖水平及血糖波動狀態。

糖尿病血脂異常、炎癥反應長期存在、抗氧化能力降低是造成糖尿病病人并發癥的核心因素,特別是動脈粥樣硬化和冠心病等[21]。本研究結果顯示,與正常組比較,Model-1組和Model-2組血脂、炎性因子及抗氧化指標異常,表現為血脂TG、TC和LDL-C升高,HDL-C降低,炎性因子指標IL-1α、IL-6和TNF-α升高,抗氧化應激指標SOD和C肽降低,氧化應激指標MDA升高,Model-2組異常程度高于Model-1組。提示糖尿病血糖波動相較于普通糖尿病具有明顯的血脂異常情況、炎癥反應及抗氧化能力降低。與Model-2組相比,三生調脂舒干預后,上述指標均明顯好轉,提示三生調脂舒可改善血脂,降低炎癥反應,調節氧化應激。同時本研究觀察了糖尿病大鼠腹主動脈的變化:Con組細胞排列整齊有規則,血管壁纖維呈規則狀;Model-1組和Model-2組細胞核紊亂程度進一步加劇,同時纖維走向明顯散亂,血糖波動組嚴重,提示糖尿病血糖波動具有一定的動脈損傷,三生調脂舒治療后明顯好轉。分析與Lp-PLA2相關,Lp-PLA2又稱為血小板活化因子乙酞水解酶(PAF-AH),是一種炎性細胞(主要包括巨噬細胞、T細胞和肥大細胞),促使氧化磷脂水解的磷脂酶[22]。Lp-PLA2又反作用生成溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸等因子在內的多種脂類促炎性因子,造成IL-1α、IL-6和TNF-α等指標升高,最終導致動脈粥化硬化或冠心病的發生[23]。IL-1α、IL-6和TNF-α等炎性因子與抗氧化能力降低密切相關,可與SOD和C肽等協同作用造成機體抗氧化能力降低、動脈硬化及糖尿病等相關并發癥發生[24-25]。本研究結果也顯示,與Con組相比,Model-1組和Model-2組血清和腹主動脈組織Lp-PLA2升高,與文獻報道[25]一致,這可能是糖尿病動脈粥樣硬化發生的因素之一。采用三生調脂舒干預后,血清和腹主動脈組織Lp-PLA2含量均降低,提示三生調脂舒可能對糖尿病血糖波動大鼠血液和腹主動脈組織Lp-PLA2具有一定的抑制作用。

綜上所述,三生調脂舒對糖尿病大鼠血糖波動具有明顯的調節作用,其作用機制可能與調節Lp-PLA2表達,進而降低炎癥反應、提高抗氧化能力水平有關。