干擾SATB1抑制宮頸癌增殖和轉移能力及增強宮頸癌放射敏感性的作用研究*

喬 娟,楊 昊,牛麗紅,楊 璐,馬 敬,肖慧英

1.北京大學腫瘤醫院內蒙古醫院/內蒙古醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科,內蒙古呼和浩特 010020;2.北京大學腫瘤醫院內蒙古醫院/內蒙古醫科大學附屬腫瘤醫院放療科,內蒙古呼和浩特 010020;3.內蒙古自治區呼和浩特市第一醫院婦產科,內蒙古呼和浩特 010030

宮頸癌是全球第四大最常見的癌癥和婦科癌癥相關死亡的原因。據相關報道統計,在2020年全球約有60萬名婦女被診斷患有宮頸癌,約34萬人死于宮頸癌[1]。雖然宮頸癌通過化療、放療和手術切除等治療改善了早期宮頸癌患者的預后,但是晚期患者的放療敏感性低下和存在化療耐藥性,常常導致復發、轉移甚至死亡,這嚴重影響了宮頸癌治療的效果,限制了同步放化療的臨床應用[2]。因此,需要深入了解宮頸癌發展的機制,并尋找新的治療分子靶點來改善宮頸癌患者的治療效果。核基質結合區結合蛋白1 (SATB1)基因位于3號染色體3短臂23區上,介導染色質重塑,進行基因調控[2]。有研究報道,SATB1在多種腫瘤中過度表達,并發揮促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移等重要作用[3-5]。ZHAO等[6]研究發現,SATB1在宮頸癌組織中呈高表達,且SATB1高表達患者與國際發立科聯合會(FIGO)分期、組織學分級和不良預后相關。SATB1作為p21活化激酶5(PAK5)和微小RNA-100(miR-100)的下游調控基因參與調控宮頸癌細胞的侵襲和轉移能力[7]。同時,SATB1在腫瘤治療抵抗中也發揮著促進作用,直腸癌放療患者中報道SATB1陽性與患者術前放療反應降低、早期轉移和生存率降低呈獨立相關性[8]。但SATB1是否與宮頸癌患者放療敏感性相關尚不清楚,本文對SATB1在宮頸癌增殖、轉移和放療抵抗中發揮的作用進行研究,旨在探討SATB1作為宮頸癌治療的潛在分子靶點的依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集入住北京大學腫瘤醫院內蒙古醫院/內蒙古醫科大學附屬腫瘤醫院(下稱本院)并行子宮手術切除的62例宮頸癌患者的成對的癌組織和相鄰的非腫瘤組織。納入標準:(1)首次確診為宮頸癌,并經病理證實;(2)手術前未接受過任何形式的抗腫瘤治療;(3)原發性宮頸癌,未發生轉移,并且未合并其他類型的惡性腫瘤;(4)手術時間為2014年8月至2017年10月,并且具有完整的隨訪資料;(5)簽署患者知情同意書。本研究所有標本操作均由本院倫理委員會審核通過。

1.2主要試劑 無水乙醇、甲醛及二甲苯(廣東中海南聯能源有限公司);DAKO免疫組化檢測試劑盒(丹麥);枸櫞酸鈉抗原修復液和PARP蛋白裂解液(北京索萊寶試劑公司);宮頸癌腸轉移細胞(CaSki)(美國ATCC細胞庫);細胞培養基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(美國Gibco試劑公司);SATB1 siRNA(廣州銳博生物生物技術有限公司);蛋白高效裂解液(北京Solarbio試劑有限公司);蛋白上樣緩沖液和BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天試劑有限公司);PVDF膜(美國Promega公司);ECL化學發光試劑盒(翌圣生物科技上海有限公司);CCK8檢測試劑(英國Abcam公司);Transwell小室(美國Coring公司);SATB1一抗和鼠二抗、兔二抗(美國Proteintech公司)。

1.3免疫組化 所有癌組織和相鄰的非腫瘤組織樣本均用福爾馬林固定24 h。用標準技術將其包埋為石蠟蠟塊,并經切片機制成4 μm厚的切片。根據免疫組化檢測試劑盒的說明書進行免疫組織化學染色。用小鼠IgG代替一抗作為陰性對照。然后,使用顯微鏡觀察切片。在高倍鏡下,在每個切片的5個隨機選擇的視野中測定染色陽性細胞的數量和強度。陽性細胞百分比評分如下:1分為<5%;2分為5%～25%;3分為>25%～50%;4分為>50%～75%; 5分為>75%。強度評分如下:0分為無染色;1分為弱染色;2分為中度染色;3分為強染色。使用以下公式計算總得分:總得分=百分比得分×強度得分。<2分被定義為陰性,≥2分被定義為陽性。

1.4細胞培養和轉染 CaSki細胞復蘇后,800 r/min離心去除凍存液,放置在含有10%FBS的PRMI 1640培養基中,于37 ℃、5%CO2培養箱中培養,在倒置顯微鏡下觀察細胞生長。每2天更換一次培養基,待細胞生長至約80%,用胰蛋白酶消化傳代。取生長良好的細胞進行后續的實驗研究。

1.5細胞轉染 取生長良好的細胞,在第1天晚上接種至6孔板中,每孔的細胞密度為70%～80%,并確保細胞均勻分布在6孔板的底部。待細胞貼壁后,隨機分為si-NC組和si-SATB1組,并于當天上午進行質粒轉染;si-NC組轉染2.5 μg NC siRNA和10 μL Lipo3000;si-SATB1組轉染2.5 μg SATB1 siRNA和10 μL Lipo3000。NC siRNA序列為5′-AAG TCT TCT GAC GCT GCT GCC TGG TCC AG-3′,SATB1 siRNA序列為5′-AGA TTC AGC AGG AAA TGA AGC GTG CTA AA-3′ 。轉染48 h后進行采用Western blotting檢測轉染效果。

1.6CCK8實驗 細胞增殖能力檢測:轉染48 h后,各組細胞經胰蛋白酶處理,制備成單細胞懸浮液,進行細胞計數,并采用無血清培養基調整細胞濃度至2×103個/毫升,均勻地鋪至96孔板中,在細胞貼壁后計為0點,每隔24 h計為1個時間點,時間點分別計為0、24、48、72和96 h,每個時間點設置6個復孔,放置在37 ℃和5% CO2飽和濕度下培養。在相對應的時間點加入20 μL CCK8試劑,繼續孵育2 h。采用酶標儀檢測450 nm處各孔細胞的吸光度(A)值。

細胞放療敏感性檢測:轉染48 h后,各組細胞經胰蛋白酶處理,制備成單細胞懸浮液。進行細胞計數,并采用無血清培養基調整細胞濃度至2×103個/毫升,均勻地鋪至96孔板中,在細胞貼壁后,隨機分為0、2、4、6和8 Gy,每組設置6個復孔,進行相應放射劑量的照射,放置在37 ℃和5% CO2飽和濕度下培養48 h,并每孔細胞加入20 μL CCK8試劑,繼續孵育2 h。采用酶標儀檢測450 nm處各孔細胞的A值,計算細胞存活率=對應放射劑量細胞A值/0 Gy細胞A值。

1.7Transwell實驗 轉染48 h后,各組細胞經胰蛋白酶處理,制備成單細胞懸浮液。用無血清培養基洗滌細胞2次后,進行細胞計數,并采用無血清培養基調整細胞濃度至1×105個/毫升。取100 μL細胞懸浮液緩慢滴入Transwell小室的上室中的聚碳酸酯膜上。取500 μL含有10%胎牛血清的完整培養基加入下室腔中,并在37 ℃和5% CO2飽和濕度下培養12 h。用棉簽輕輕擦拭并清洗上室膜上未穿透膜的細胞。用甲醇固定細胞15 min,蘇木精染色10 min,干燥后,用刀片輕輕切割聚碳酸酯膜至載玻片上,并用中性樹膠固定。在顯微鏡下觀察穿過膜的細胞數量。隨機選擇5個高倍視野,并拍攝和記錄。

1.8Western blotting檢測蛋白表達 轉染48 h后,丟棄細胞培養基。用PBS洗滌3次后,加入制備的RIPA細胞裂解緩沖液(1×RIPA∶100×CK∶100×磷酸酶抑制劑=100∶1∶1)以充分裂解。將裂解物吸入標記的EP管中,放置于超聲機中裂解30 min。12 000×g離心30 min,將上清液轉移到新的EP管中。用BCA蛋白質定量試劑盒測定蛋白質濃度。將蛋白質樣品與5×SDS加載緩沖液的以體積比4∶1混合,在95 ℃水浴中煮沸10 min。配置10%聚丙烯酰胺凝膠,加樣后進行凝膠電泳,濕轉移120 min至PVDF膜上。5%脫脂奶粉孵育PVDF膜60 min,并加入一抗稀釋液在4 ℃下孵育過夜。采用TBST洗滌10 min×3次,加入按適當比例稀釋的二抗,室溫孵育60 min,采用TBST洗滌10 min×3次,采用ECL發光試劑盒暴露并計算目的蛋白的表達水平。

2 結 果

2.1免疫組化檢測 SATB1在宮頸癌組織中的表達水平 免疫組化檢測結果顯示,SATB1在宮頸癌組織和相鄰的非腫瘤組織中的陽性表達率分別為53.23%(33/62)和32.26%(20/62)。與非腫瘤組織中SATB1的表達相比,宮頸癌組織中SATB1的陽性表達率顯著升高(χ2=5.569,P=0.018),見圖1。

圖1 免疫組化檢測SATB1在宮頸癌組織中的表達水平(×100)

2.2SATB1表達水平與宮頸癌患者臨床病理參數的關系χ2檢驗分析顯示,SATB1的表達水平與宮頸癌患者的年齡、組織學類型、分化程度和肌層浸潤深度均無相關性(P>0.05),與宮頸癌腫瘤最大徑、FIGO分期和淋巴結轉移顯著相關,SATB1在腫瘤最大徑較大、FIGO分期晚期及淋巴結轉移的宮頸癌組織中SATB1的陽性表達率升高(P<0.05)。見表1。

表1 SATB1的表達水平與患者臨床病理參數的關系[n(%)]

2.3SATB1表達水平對宮頸癌患者預后的影響 采用Kaplan-Meier繪制生存曲線,Log-Rank分析SATB1表達水平對宮頸癌患者生存預后的影響。與低表達SATB1的宮頸癌患者相比,高表達SATB1的宮頸癌患者預后較差(χ2=5.73,P=0.017),見圖2。

圖2 Log-Rank分析SATB1對宮頸癌患者預后

2.4Western blotting檢測SATB1 siRNA轉染宮頸癌細胞CaSki的效果 采用Western blotting檢測SATB1 siRNA轉染宮頸癌細胞CaSki的效果,結果顯示si-NC組和si-SATB1組SATB1蛋白表達量分別為(0.73±0.14)和(0.25±0.04),與si-NC組相比,si-SATB1組細胞中SATB1蛋白表達量顯著降低,差異有統計學意義(t=5.710,P=0.002),見圖3。

圖3 Western blotting檢測SATB1 siRNA轉染宮頸癌細胞效果

2.5CCK8實驗檢測SATB1 siRNA對宮頸癌細胞CaSki增殖能力的影響 CCK8實驗結果顯示與si-NC組細胞相比,si-SATB1組CaSki細胞增殖能力降低,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4和表2。

表2 不同時間點各組CaSki細胞的A值

圖4 CCK8實驗檢測SATB1 siRNA對宮頸癌細胞CaSki增殖能力的影響

2.6Transwell實驗檢測SATB1 siRNA對宮頸癌細胞CaSki轉移能力的影響 Transwell實驗結果顯示,si-NC組和si-SATB1組穿膜細胞數目為(86.67±12.95)個和(52.33±9.04)個,與si-NC組細胞相比,si-SATB1組CaSki細胞轉移能力顯著降低,差異有統計學意義(t=3.766,P=0.013),見圖5。

2.7CCK8實驗檢測SATB1 siRNA對宮頸癌細胞CaSki放療敏感性的影響 CCK8實驗結果顯示,與si-NC組相比,si-SATB1組CaSki細胞的細胞存活率降低,放療敏感性升高,差異有統計學意義(P<0.05),見圖6和表3。

表3 不同放射劑量處理各組CaSki細胞的細胞存活率

圖6 CCK8實驗檢測SATB1 siRNA對宮頸癌細胞CaSki放療敏感性的影響

2.8SATB1 siRNA對CaSki細胞Wnt/β-catenin信號通路及其下游基因表達的影響 Western blotting實驗結果顯示,與si-NC組細胞相比,si-SATB1組CaSki細胞中Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白β-catenin及其下游蛋白cyclinD1、cMYC和MMP-2表達水平均降低,差異有統計學意義(P<0.05),見圖7和表4。

表4 干擾SATB1的表達對Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白及其下游基因表達的影響

圖7 Western blotting實驗檢測SATB1對CaSki細胞細胞周期蛋白和轉移蛋白表達的影響

3 討 論

宮頸癌的發病多歸因于人類乳頭瘤病毒(HPV)感染,盡管有效的早期篩查和HPV疫苗接種大大降低了世界范圍內的宮頸癌發病率和病死率,但宮頸癌的臨床癥狀和體征在早期仍然隱匿,不易被發現,確診時往往已處于晚期,導致患者臨床治療效果較差及生存預后不佳,特別是在低收入國家[1]。因此,識別新的治療靶點對于提供用于宮頸癌治療的有價值的策略具有重要的研究意義。有研究顯示,轉錄調控蛋白在調控基因轉錄過程中不僅影響染色體基因表達的數目,還可以對染色體基因表達造成影響,其表達水平異?？蓪е录毎L發育異常,引起腫瘤的發生發展。SATB1屬于轉錄調控蛋白的一員,SATB1通過與核基質結合,誘導形成3D染色質環,以及通過調控表觀遺傳組學包括甲基化和乙酰化調控1 000多個基因表達[2]。同時,SATB1是一種T細胞特異性因子,參與胸腺細胞的發育。研究顯示,SATB1在腫瘤中的表達水平異常,并在腫瘤的惡性進展中發揮關鍵作用[9]。

有研究報道,SATB1在前列腺癌、胃癌和非小細胞肺癌等實體瘤[3-5]、急性髓系白血病和皮膚T細胞淋巴瘤等[10-11]血液系統腫瘤中均發揮促癌作用。在前列腺癌組織中SATB1表達水平增加,SATB1表達水平與患者術前前列腺特異抗原水平、術后Gleason評分、TNM分期和淋巴結轉移相關[3]。在胃癌中,SATB1敲低通過抑制HER3的表達水平,消除HRG對MET的抑制作用,增加胃癌細胞化療的敏感性[4]。SATB1作為非小細胞肺癌中上皮-間質轉化過程中的調節因子。這均表明SATB1在惡性腫瘤中發揮關鍵作用[5],但是SATB1在宮頸癌中發揮的具體作用尚未見明確報道。ZHAO等[6]對33例宮頸癌組織檢測結果顯示,SATB1在宮頸癌組織中表達水平升高,且SATB1高表達組患者FIGO分期、組織學分級及預后均顯示不良,SATB1在宮頸腺癌中的表達水平顯著高于在宮頸鱗狀細胞癌中的表達水平。本文檢測了62對宮頸癌組織和非癌組織中SATB1的表達水平情況,同樣得出SATB1在宮頸癌組織中呈高表達,并與宮頸癌腫瘤最大徑、FIGO分期和淋巴結轉移顯著相關,但是并沒有顯示SATB1表達水平與宮頸癌組織類型相關,宮頸癌有兩種主要類型:宮頸鱗狀細胞癌和宮頸腺癌,其中宮頸鱗狀細胞癌占80%～85%[12],ZHAO等[6]研究中包含的宮頸腺癌例數為8例,本文中宮頸腺癌的例數為10例,分析原因可能是樣本量較小,后續會擴大樣本量進一步研究。

在組織水平的研究已提示SATB1發揮促癌作用的情況下,HUO等[7]報道PAK5通過介導SATB1的Ser47位點磷酸化啟動上皮間質轉化過程級聯反應,促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力。同時SATB1在胃癌和鼻咽癌中促進腫瘤細胞的增殖和轉移能力[4,13],提示SATB1可能促進宮頸癌細胞的增殖和轉移能力,本文在宮頸癌細胞中干擾SATB1的表達水平后發現宮頸癌細胞的增殖和轉移能力降低,表明SATB1促進宮頸癌細胞增殖和轉移。有研究報道,在直腸癌中降低SATB1的表達并增強直腸癌細胞敏感性,SATB1可預測直腸癌術前放療的反應和臨床結果[8]。本文在放射處理宮頸癌細胞并干擾SATB1的表達水平后,發現干擾SATB1的表達水平會增強宮頸癌細胞的放療敏感性。RAO等[14]報道SATB1靶向β-catenin促進滋養細胞的侵襲和遷移能力,以及在肺癌細胞中miR-448靶向SATB1抑制Wnt/β-catenin途徑抵抗腫瘤細胞順鉑耐藥性[15],均提示SATB1與Wnt/β-catenin信號通路的調控密切相關。Wnt/β-catenin是促進腫瘤增殖、轉移、化療耐藥及放療抵抗等惡性生物學行為的重要信號通路,在宮頸癌中也處于激活狀態[16]。經典的Wnt/β-catenin信號通路的活化需要β-catenin累積入細胞核,激活下游的靶基因,包括增殖、侵襲轉移、凋亡、耐藥、放療抵抗及干性等基因,其中cyclinD1、cMYC為增殖相關基因,MMP-2為侵襲轉移相關基因[17],而本研究發現干擾SATB1的表達后宮頸癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路中關鍵蛋白β-catenin及其下游蛋白cyclinD1、cMYC和MMP2表達均降低,與RAO等[14]和NING等[15]報道的一致,均顯示SATB1通過靶向β-catenin激活Wnt/β-catenin信號通路發揮作用,不同的是在發揮的作用不同,而本研究提示SATB1可能通過下調Wnt/β-catenin信號通路抑制宮頸癌細胞增殖、轉移能力和增強放療敏感性。但是SATB1在宮頸癌發揮生物學功能的作用機制仍需后續深入探討。

綜上所述,SATB1在宮頸癌中高表達,可能是患者預后不良的分子標志物,同時SATB1可能通過上調Wnt/β-catenin信號通路促進宮頸癌細胞增殖和轉移能力,并促進宮頸癌細胞放療抵抗。SATB1具有作為治療宮頸癌分子靶點的潛力。