心痛泰含藥血清干預PI3K/Akt/HIF-1α通路抑制兔主動脈平滑肌細胞凋亡的作用機制*

易瓊，彭清華，郭志華，彭筱平，魏佳明

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學 長沙 410208；3.湖南省直中醫醫院 株洲 412008）

我國持續上升的心血管病發病率造成了沉重的社會經濟負擔。《中國心血管健康與疾病報告2021》[1]研究發現，中國的心血管病患者超過3億，患有冠心病的人數約1139萬，每年發生心源性猝死的病患約54.4萬例。動脈粥樣硬化是易損斑塊形成的病理基礎，冠心病患者發生心源性猝死的主要原因是易損斑塊中纖維帽破裂導致出血，因此，纖維帽的穩定性至關重要。平滑肌細胞（Aortic vascular smooth muscle cell，VSMC）是斑塊纖維帽的重要成分之一，參與合成細胞外基質來穩定斑塊，在氧化應激、缺血缺氧、ox-LDL等刺激下，VSMC可發生凋亡、壞死[2]。易損斑塊中存在大量VSMC凋亡和纖維帽中VSMC數量減少[3]。因此，對調控某些關鍵通路來減輕VSMC凋亡，是穩定易損斑塊的重要治療方向。

心痛泰在“心受氣于脾”的理論基礎上組方，全方具有化痰祛瘀通絡之功，適用于痰瘀互結型冠心病的患者。飲食不節、肝郁氣滯等因素導致脾氣虛弱，脾虛生痰，痰凝脈道，久而成瘀，痰瘀互結則形成病理產物——“斑塊”。課題組的前期研究顯示，心痛泰可減輕炎癥反應、改善血管重構、減少斑塊纖維帽中的膠原分解，從而穩定動脈斑塊，初步闡釋了心痛泰干預斑塊VSMC的潛在作用[4-7]。VSMC是斑塊纖維帽的主要成分，因此，在前期基礎上，進一步探索心痛泰對斑塊纖維帽中VSMC的具體作用機制。

網絡藥理學是采用網絡拓撲結構分析來解釋藥物、靶標、信號通路、疾病之間的關聯性的一種方法，為中藥復方的有效成分、藥理機制、作用靶點提供精準的研究思路[8]。課題組通過生物信息學方法，預測心痛泰作用靶點PI3K/Akt/HIF-1α信號通路，構建信息網絡分析靶蛋白及其功能，采用TCMSP、TCMID、TCMIP等多個數據庫及文獻報道，分析了心痛泰對動脈斑塊中平滑肌細胞凋亡的潛在作用機制，再通過細胞實驗驗證心痛泰含藥血清對兔VSMC凋亡的效果，人兔基因同源，本研究采用ox-LDL誘導兔VSMC凋亡，模擬動脈硬化斑塊中的平滑肌細胞模型[9]。文獻報道，PI3K/Akt/HIF-1α通路的上調參與了脂質核心的增大、斑塊膠原的缺失、炎癥因子的釋放等過程，直接影響斑塊的穩定性[10-11]。PI3K抑制劑可以減輕動脈粥樣硬化的發生和發展[12]。本研究通過CCK8法篩選出干預實驗兔主動脈VSMC的最適心痛泰含藥血清濃度；構建ox-LDL導致VSMC凋亡的細胞模型，探討心痛泰含藥血清干預VSMC后，PI3K/Akt/HIF-1α通路以及凋亡相關因子的變化，采用TUNEL法和流式細胞術檢測VSMC凋亡程度和凋亡率，細胞熒光染色檢測VSMC中α-SMA的熒光強度，從而探索心痛泰抑制VSMC凋亡的具體分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞

雄性日本大耳白兔，10-12周齡，體質量（2.19±0.135）kg。由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（湘）2009-0012，許可證號：湘醫動字D20-006號。實驗已通過湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查（倫理批號：ZYFY20160515）。實驗兔主動脈平滑肌細胞購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司（批號：RAB-iCell-c004）。

1.2 藥物

心痛泰具體藥物組成及來源：丹參（批號HH23032102）、川芎（批號2212120112）、三七（批號20220620）、郁金（批號2022030201）、山楂（批號2212028）、枳殼（批號HY23032302）、葛根（批號GW23032702）、木香（批號220201），購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院門診中藥方。按丹參∶川芎∶三七∶郁金∶山楂∶枳殼∶葛根∶木香=1.5∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶0.5的比例組成，經過標準流程制成藥粉，每克藥粉相當于15 g生藥。由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科制備，嚴格控制每一批次的藥品質量濃度，符合標準質量濃度的方可用于后續研究。由于本實驗探討心痛泰含藥血清對PI3K通路的抑制作用，因此選擇PI3K通路抑制劑LY294002（Cell Signaling Technology，批號9901S）作為通路對照。

1.3 儀器與試劑

CO2細胞培養箱（上海博迅實業有限公司，BCJ160S）；熒光倒置顯微鏡（Nikon，DS-Ri2）；高速冷凍離心機（Thermo Fisher，Multifuge X1R）；流式細胞儀（美國BD公司，FACSCanto11）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司，DHG-9123A）；CCK-8檢測試劑（日本北仁，批號CK04）；T25細胞培養瓶（Coming，430639）；24孔板專用細胞爬片（Solarbio，YA0350）；平滑肌細胞完全培養基（賽百慷上海生物技術股份有限公司，PriMed-iCell-004）；人源ox-LDL（上海懋康生物科技有限公司，MP6009-2MG）；FITC Annexin V apoptosis detection kit I凋亡試劑盒（美國BD公司，556547）；四甲基羅丹明-dUTP（Tetramethyl-Rhodamine-5-UTP，TMR）紅色熒光染料（武漢賽維爾生物科技有限公司，G1502-50T）；即用型4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液（凱基生物，KGA215-50）；0.25%胰蛋白酶（Gbico，1734858）；山羊血清（Solarbio，S9070）；α-SMA（北京博奧森生物技術有限公司，Bsm-33188M）；Fluoromount-G熒光封片劑（SourthernBiotech，0100-01）；PI3K抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bsm-52218R）；Akt抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-3346R）；HIF-1α抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-0737R）；caspase-3抗體（abcam公司，批號：32351）；caspase-9抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bsm-52566R）；內參β-actin（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bsm-33036m）；羊抗兔HRP標記二抗（碧云天生物技術研究所，批號：A0208）；羊抗鼠HRP標記二抗（碧云天生物技術研究所，批號：A0216）。

1.4 數據庫與軟件

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCSMP（http://tcmspw.com/tcmsp.php），中醫藥綜合數據庫TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/），中醫藥整合藥理學網絡計算研究平臺TCMIP（http://www.tcmip.cn/），三維結構顯示軟件，藥物信息綜合數據庫PubChem（PC）數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），人類基因綜合分析數據庫GeneCards（GC）（https://www.genecards.org/），生物信息學數據庫Bioinformatics Gent（BG）中的Van de Peer Lab在線工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），小分子藥物靶點預測在線分析平臺SwissTargetPrediction（STP）（http://www.swisstargetprediction.ch/），蛋白相互作用數據庫STRING在線分析平臺（https://string-db.org/），Cytoscape軟件，WebGestalt（WG）數據庫（http://www.webgestalt.org/#），Funtional Database（FD）數據庫（WG的子數據庫），生物信息學數據庫DAVID在線分析數據庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），蛋白質結構（ProreinData Bank，PDB）數據庫（https://www.rcsb.org/）。

1.5 細胞培養、傳代及鑒定

復蘇實驗兔主動脈VSMC，2000 r·min-1離心5 min，去掉上清液，加入胎牛血清和培養基接種于培養瓶中，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，按時更換培養基，細胞融合80%-90%行傳代培養，0.05%胰蛋白酶消化傳代到3-4代，取3-4代生長良好、純度90%以上的細胞用于實驗。

1.6 心痛泰含藥血清的制備及最佳濃度篩選

12只實驗兔適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組、心痛泰低、中、高劑量組，每組3只。按照實驗兔與成人的體表面積折算公式進行換算給藥劑量。根據人臨床等效劑量換算，換算成兔的心痛泰中劑量給藥劑量為4.6 g·kg-1·d-1，減半為心痛泰低劑量2.3 g·kg-1·d-1給藥組，加倍為心痛泰高劑量9.2 g·kg-1·d-1給藥組。正常對照組生理鹽水灌胃。每日灌胃2次，連續灌胃1周。各組于末次給藥3 h后，2%戊巴比妥腹腔麻醉并左側股動脈采血，于4℃靜置4 h，3500 r·min-1離心10 min取血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm無菌微孔過濾除菌，分裝入小瓶，置于-20℃冰箱中保存備用。

取對數生長期的VSMC，胰蛋白酶消化，制作6×104個·mL-1的單細胞懸液，加入96孔板，細胞分為空白血清、心痛泰各劑量含藥血清組分別設置5%、10%、20%、30%四個濃度，培養基中按比例加入含藥血清，每組3個復孔，分別于24 h、48 h、72 h后終止培養，培養至所需時間后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，培養中孵育2 h，酶標儀在450 nm波長檢測每孔的吸光值（OD），GraphPad軟件計算細胞增殖率。選擇對VSMC增殖率高的干預濃度進行后續實驗。

1.7 細胞分組

VSMC細胞分為5組：空白血清組、模型組（50 mg·L-1ox-LDL）、心痛泰含藥血清組（50 mg·L-1ox-LDL+心痛泰含藥血清）、LY294002組（50 mg·L-1ox-LDL+10 μmol·L-1LY294002）、心痛泰含藥血清+LY294002組（50 mg·L-1ox-LDL+心痛泰含藥血清+10 μmol·L-1LY294002）。

1.8 成分及靶點篩選

1.8.1 中藥活性化合物收集及篩選

利用TCMSP、TCMID、TCMIP數據庫，收集心痛泰中中藥飲片的主要化學成分。根據人體藥物代謝動力學參數[13-14]，以口服生物利用度≥30%，化合物類藥性≥0.18為篩選條件，初步篩選出心痛泰有效高活性化合物。

1.8.2 心痛泰作用靶點預測與“中藥-疾病-表型”共同靶點篩選

TCMSP收集心痛泰有效高活性化合物成分后，將相關的活性化合物成分導入STP數據庫，剔除無關成分，預測心痛泰與動脈粥樣硬化和細胞凋亡相關的潛在靶點。將“動脈粥樣硬化”、“細胞凋亡”的檢索詞納入GeneCards數據庫中檢索，收集“動脈粥樣硬化”、“細胞凋亡”的作用靶點。通過BG數據庫中Van de Peer Lab在線工具取交集獲得“心痛泰”、“動脈粥樣硬化”和“細胞凋亡”三者密切相關的潛在共同靶點，并繪制韋恩圖。

1.8.3 共同靶點關鍵基因篩選及蛋白PPI網絡構建

將預測到的靶點導入String數據庫，選擇Multiple Protenin，限定物種為Homo sapiens，設定最低要求互動分數為最高可信度0.900[15]，得到PPI相關數據并導出數值，再將相關數值導入Cytoscape軟件，得到可視化的PPI圖，軟件計算Degree值。使用Cytoscape軟件中CytoHubba中的算法分別對PPI網絡圖進行亞網絡拓撲分析，篩出拓撲分析中前20位基因取并集，整合出關鍵基因。

1.8.4 共同靶點GO和KEGG富集分析

在WG數據庫中設定物種為“Homo sapiens”，采用ORA算法分析，選用FD子數據庫，進行GO富集分析。進階參數設定中，設定P＜0.05，余為默認設置。收集BP、CC、MF富集分析數據，進行“加權集合覆蓋”分析，并繪制火山圖。同時對利用DAVID數據庫對共同靶點關鍵基因進行KEGG富集分析，繪制柱狀圖，并對富集分析結果進行亞網絡拓撲分析，繪制“靶點-通路”弦圖。

1.9 指標檢測及方法

1.9.1 TUNEL法檢測VSMC凋亡率

將VSMC細胞接種于24孔板，每孔密度1×105，石蠟切片、脫水，緩沖液及3%過氧化氫溶液中孵育20 min，PBS洗滌3次，按照TUNEL試劑盒說明在樣品中加入檢測液，避光孵育1 h，PBS洗滌，DAPI孵育5 min復染細胞核，PBS清洗后使用防淬滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察。采用MIAS圖像分析系統統計陽性（凋亡）細胞數和陰性（正常）細胞數，并計算凋亡細胞占總體細胞中的百分比，隨機在5個不重復視野計算，取平均值。

1.9.2 流式細胞術檢測VSMC凋亡率

將各組兔主動脈VSMC調整為1×106個·mL-1，與10 μL Annexin V-FITC及PI避光孵育（15 min）后流式儀檢測ASMCs細胞凋亡率。

1.9.3 PCR法測定PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA表達

按TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，VSMC以1×10個·mL-1接種于6孔板中，每孔加入1 mL TRIzol，冰上放置5 min，槍頭吹打，將細胞收集到離心管，室溫放置5-10 min使細胞充分裂解后，加入4℃的氯仿，震蕩15 s，冰盒上靜置5 min，75360 r·min-14℃低溫高速離心15 min，分層后取水相層（主要含有RNA），加入4℃預冷的無水乙醇，混勻。將上步所得溶液全部加入到吸附柱（Spin Colums RM）中，在4℃，75360 r·min-1條件下離心30 s，保留流出液。在留出液中加入2/3體積無水乙醇（4℃預冷），混勻，棄流出液，離心2 min，將吸附柱裝入RNase-Free離心管中，加入38 μL RNase Free H2O（4℃預冷），冰盒上靜置3-5 min，充分溶解miRNA，重復上述步驟，得到的miRNA液保存在-80℃冰箱或液氮中，防止降解。使用紫外分光光度計檢測所提取的RNA溶液在260 nm、280 nm、320 nm處的吸光值，計算濃度及純度。利用Primer Premier 5.0軟件設計PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9、β-actin的引物序列。按說明書將RNA通過逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，配制熒光定量PCR，采用熒光定量PCR法測定VSMC中PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA表達。數據采用2-ΔΔCT法計算分析基因表達水平。委托上海生工生物股份有限公司設計與合成，各基因的mRNA引物見表1。

表1 PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA引物

1.9.4 Western blot法測定p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表達

棄掉培養液，每孔加入200 μL的RIPA裂解液，細胞破碎儀破碎細胞，離心機（4℃ 75360 r·min-1）離心15 min取上清，稀釋BSA標準品，配置BCA工作液。測定BSA標準品及每個樣品的吸光值，同時做好記錄。繪制標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度，根據每次上樣蛋白量為20 μg計算出每次上樣體積。按照配方配好分離膠，無水乙醇壓膠，加入一定體積的蛋白樣品和Marker上樣。配制1×電泳液，用1×電泳液浸沒膠板，開始電泳（60 V壓縮蛋白，80 V分離蛋白），300 mA恒流轉膜30 min。根據說明書（p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9均為1∶1000）封閉膜，孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，按照1∶1000稀釋HRP標記的二抗，與膜37℃孵育1 h，最后行ECL化學發光檢測顯影，曝光，掃描蛋白條帶。Gel Image ststem ver4.0軟件分析。其中，PI3K、Akt的蛋白表達，分別p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值進行分析。

1.9.5 免疫熒光染色檢測各組VSMC中α-SMA的熒光定量

在培養板中將已爬好VSMC細胞的培養皿用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培養皿3次，每次3 min。在玻片上滴加5% BSA，37℃封閉30 min。吸干封閉液，培養皿滴加足夠量的稀釋好的一抗：α-SMA（1∶100），4℃冰箱一抗孵育過夜，滴加稀釋好的熒光二抗488（1∶200），37℃孵育30 min，PBS充分淋洗。滴加DAPI避光孵育3 min，對標本進行染核，用PBS沖洗多余的DAPI，用50%甘油封閉培養皿。洗滌后滴加抗熒光淬滅劑，隨后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。采用Image J軟件對所有樣本進行平均熒光強度的半定量分析。

1.10 統計學方法

生信數據統計分析及作圖使用GraphPad Prism 8.0.1（244）軟件。實驗數據使用SPSS 23.0分析，以均值±標準差（±s）表示，所有結果均符合正態分布，多組之間的比較采用單因素方差分析（ANOVA），進一步兩兩比較，所有結果方差齊，因此采用LSD法。P＜0.05有統計學差異，P＜0.01有顯著統計學差異。

2 結果

2.1 心痛泰含藥血清最佳質量濃度（對VSMC增殖的影響）的篩選結果

在5%、10%藥物濃度下，與空白組比較，心痛泰低劑量組、心痛泰中劑量組、心痛泰高劑量組含藥血清的OD值均升高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；心痛泰高劑量組在5%和10%濃度下的OD值較空白組升高（P＜0.05或P＜0.01），但在20%和30%濃度下的OD值較空白組下降。心痛泰低劑量組在5%、10%、20%、30%濃度下的增殖率分別是134.25%、153.47%、168.16%、136.32%；心痛泰中劑量組在5%、10%、20%、30%濃度下的增殖率分別是147.85%、163.52%、179.35%、135.83%；心痛泰高劑量組在5%、10%、20%、30%濃度下的增殖率分別是157.35%、124.28%、93.65%、82.41%；提示20%心痛泰中劑量組對VSMC的增殖作用最強，故選取其用于體外實驗。見圖1。

圖1 心痛泰不同劑量和濃度的含藥血清對VSMC增殖的影響

2.2 心痛泰活性化合物靶點預測與“中藥-疾病-表型”共同靶點篩選的結果

通過TCMSP、TCMID、TCMIP等多個數據庫共收集心痛泰中化合物905個：其中丹參202個、木香106個、郁金222個、枳殼17個、三七119個、山楂32個、川芎189個、葛根18個；初步篩選后得出心痛泰有效高活性化合物：丹參65個、木香6個、郁金15個、枳殼5個、三七8個、山楂6個、川芎7個、葛根4個。通過STP數據庫對心痛泰中活性化合物的相關靶點進行預測，篩出心痛泰中丹參、木香、郁金、枳殼、三七、山楂、川芎、葛根共741個靶點。通過GC數據庫數據，收集得到動脈粥樣硬化靶點共4063個。通過GC數據庫，收集得到“細胞凋亡”的12493個表型靶點。使用BG數據庫提取“中藥（心痛泰活性化合物）-疾病（動脈粥樣硬化）-表型（細胞凋亡）”相交集的共同靶點，共460個。

2.3 共同靶點關鍵基因篩選及蛋白PPI網絡構建的結果

共同靶點導入String數據庫，使用String數據庫及Cytoscape軟件，對心痛泰、動脈粥樣硬化和細胞凋亡共同靶點蛋白進行網絡分析，得出PPI網絡。同時采用PPI網絡圖亞網絡拓撲分析，整合Degree、Betweenness、Closeness三種算法得到的基因，取三者并集，計算得出16個關鍵基因，排名前10的基因如下：AKT、TNF、VEGF、SRC、IL1β、EGFR、STAT3、JUN、HSP90AA1、Caspase-3。

2.4 共同靶點GO和KEGG富集分析

KEGG富集于171條信號通路，主要富集于PI3K/Akt信號通路、HIF-1α信號通路、細胞凋亡信號通路、MAPK信號通路、cAMP信號通路、腫瘤相關通路、Ras信號通路等，結果繪制成火山圖，見圖2。可見與心痛泰化合成分與細胞凋亡（圖中apoptosis）和動脈粥樣硬化（兔中fluid stress and atherosclerosis）密切相關。

圖2 KEGG富集分析結果

對KEGG富集分析的主要3條通路構建“靶點-KEGG”弦圖，如圖3。可見與心痛泰化合成分以及細胞凋亡相關的通路主要集中在PI3K/Akt（圖中紅色部分）和HIF-1α（圖中綠色部分）。

圖3 “靶點-KEGG”弦圖

2.5 心痛泰含藥血清對各組VSMC凋亡情況的比較

分別采用TUNEL法和流式細胞術檢測各組VSMC凋亡。在TUNEL檢測中，各組細胞分別采用DAPI、TMR染色，正常VSMC細胞核DAPI染色呈藍染，凋亡VSMC的細胞核TMR染色呈紅染。空白血清組DAPI藍染的細胞較多，TMR紅染的細胞很少，提示常規培養模式下，空白血清組僅有極少量的VSMC凋亡；模型組DAPI藍染的細胞減少，TMR紅染的細胞顯著增加，提示模型組的VSMC凋亡明顯增多；與模型組比較，20%心痛泰中劑量含藥血清組（以下簡稱心痛泰含藥血清組）、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組的DAPI藍染的細胞顯著較多，TMR紅染的細胞明顯減少，提示心痛泰含藥血清和LY294002干預后，VSMC的凋亡明顯減輕；與空白組比，模型組VSMC凋亡陽性細胞百分比明顯升高；與模型組比，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組的VSMC凋亡陽性細胞百分比明顯降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；與心痛泰含藥血清組比，心痛泰含藥血清+LY294002組的VSMC凋亡陽性細胞百分比無顯著差異（P＞0.05），如圖4、圖5。流式細胞術結果提示，與空白血清組比較，模型組VSMC的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均明顯增加，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組VSMC的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均明顯降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；與心痛泰含藥血清組比，心痛泰含藥血清+LY294002組的VSMC早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均無明顯差異（P＞0.05）。如圖6、圖7。

圖4 TUNEL法檢測心痛泰含藥血清對VSMC凋亡的影響（X200）

圖5 TUNEL法檢測心痛泰含藥血清對VSMC凋亡率的影響

圖6 流式細胞術檢測心痛泰含藥血清對VSMC凋亡率的影響

圖7 流式細胞術檢測心痛泰含藥血清對VSMC凋亡率的影響

2.6 心痛泰含藥血清對各組VSMC中PI3K、Akt、HIF-1α、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達的影響

與空白血清組比較，模型組PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA表達明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與心痛泰含藥血清組比，心痛泰含藥血清+LY294002組的PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA表達無明顯差異（P＞0.05）。歸一化處理的數據做成柱狀圖，見圖8。

圖8 心痛泰含藥血清對各組VSMC中PI3K/Akt/HIF-1α通路mRNA表達的影響

2.7 心痛泰含藥血清對各組VSMC中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白定量的影響

與空白血清組比較，模型組VSMC中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表達明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組VSMC中的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表達減低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。與心痛泰含藥血清組比，心痛泰含藥血清+LY294002組的PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的蛋白表達無明顯差異（P＞0.05）。見圖9、圖10。

圖9 心痛泰含藥血清對VSMC中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表達的影響

圖10 心痛泰含藥血清對VSMC中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表達的影響

2.8 心痛泰含藥血清對各組VSMC中α-SMA熒光含量的影響

免疫熒光染色顯示，與空白血清組比較，模型組VSMC中α-SMA熒光含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組VSMC中α-SMA熒光含量明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與心痛泰含藥血清組比，心痛泰含藥血清+LY294002組VSMC中α-SMA熒光含量無明顯差異（P＞0.05）。見圖11、圖12。

圖11 心痛泰含藥血清對各組VSMC中α-SMA熒光含量的影響（×400）

圖12 心痛泰含藥血清對VSMC中α-SMA平均熒光強度的影響

3 討論

冠心病急性冠脈綜合征患者的動脈內存在較多的易損斑塊（Vulnerable plaque，VP），VP致病的機制是纖維帽變薄導致斑塊破裂出血、阻塞管腔，引起急性心肌梗塞[16]。纖維帽由增殖的VSMC和細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）構成，VSMC凋亡可導致纖維帽變薄，顯著推動了易損斑塊的進展，主要表現為晚期斑塊的破裂[17]。VSMC一方面是纖維帽的骨架細胞，參與纖維帽的構成，另一方面VSMC在炎癥介質的刺激下，可合成Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維、促進彈力蛋白的分泌，膠原纖維和彈力蛋白可起到穩定纖維帽的作用[18]。晚期斑塊中的VSMC凋亡增多可導致VSMC減少，膠原纖維和彈力蛋白和合成減少，致使纖維帽變薄，其肩部極易破裂[19]。Clarke等[20]的研究發現：ApoE-/-小鼠模型中，VSMC凋亡可導致斑塊的纖維帽變薄、膠原和基質丟失、細胞碎片堆積和內膜炎癥等現象。斑塊破裂后，在凝血因子Ⅴ和Ⅶ的影響下，凋亡的VSMC可通過暴露在其表面的磷脂酰絲氨酸（產生凝血酶的底物）直接生成血栓[21]，臨床上表現為急性冠狀動脈綜合征。急性冠脈綜合征患者的動脈斑塊中VSMC凋亡率較高，凋亡的VSMC在血管壁內聚集，釋放大量的炎性介質和細胞因子，引發炎癥反應和繼發性壞死，致使易損斑塊的壞死核心不斷擴大[22-23]。機制圖見圖13。

圖13 VSMC凋亡導致易損斑塊纖維帽破裂的機制

動脈硬化易損斑塊常見于冠心病、急性心肌梗塞、腦梗塞，因此中醫學中，易損斑塊屬于“胸痹”、“真心痛”、“缺血性中風”、“脈痹”等范疇。病機以肝、脾、腎虧虛為本，痰濁、血瘀為標，其中，脾虛生痰是痰瘀互結病機的根源，脾虛失運，氣血生化無源則新生血管無以穩固[24]。中醫認為過食肥甘厚味，損傷脾胃，脾失健運、脾虛生痰，痰濁凝聚，沉積于動脈內膜則發為粥樣斑塊[25]。文獻回顧表明，中醫藥對于易損斑塊中的VSMC凋亡具有抑制作用[26]。本研究的中藥復方為心痛泰，心痛泰由丹參、川芎、三七、郁金、山楂、枳殼、葛根、木香等中藥組成。其中，丹參、川芎共為君藥，具有活血化瘀之功效；枳殼、木香、葛根，升清降濁，可助脾運氣、助心行血；三七、郁金，行氣活血祛瘀；山楂消積化滯。全方有理氣化痰、活血祛瘀之效。課題組的心痛泰前期基礎扎實，且前期研究已證實，心痛泰可下調基質金屬蛋白酶-9，上調基質金屬蛋白酶抑制物-1，減輕斑塊中VSMC周圍膠原纖維的分解，增加纖維帽的穩定性，從而穩定易損斑塊[7]。

磷酯酰肌醇激酶（PI3K）家族是細胞調節具第二信使特征脂類衍生物生成的重要催化酶，直接影響動脈粥樣硬化的發生發展，具有增加VSMC凋亡、促進動脈粥樣硬化的作用[27]。PI3K/Akt/HIF-1α信號通路與細胞凋亡密切相關，PI3K激活催化產生PIP3，PIP3可以與下游的信號分子Akt結合，Akt可被PDK1和PDK2磷酸化而激活，磷酸化的Akt可調控多種病理生理過程，例如促進蛋白合成和抑制細胞凋亡[28]。抑制PI3K/Akt信號通路可減輕動脈平滑肌細胞的凋亡[29]。HIF-1α是缺氧誘導因子，在缺氧的條件下可調控多種基因的表達。臨床研究表明，血清HIF-1α水平的升高與急性心肌梗塞的發生、發展及患者預后有密切的關系[30]。凋亡是一種細胞程序化死亡的形式，可通過內源性或外源性兩種途徑實現。同型半胱氨酸蛋白酶家族（Caspase）和Bcl-2家族是凋亡的主要調控因子，不論內源性或是外源性凋亡途徑的激活均可由Caspase家族介導，且Caspase-3為大多數凋亡途徑的執行蛋白，Caspase-3的激活可促進細胞凋亡。實驗研究表明，模型大鼠血管中層VSMC凋亡時，Caspase-3的蛋白表達明顯增多[31]。

本研究以VSMC為研究對象，采用生物信息學方法初步篩查出與心痛泰、動脈硬化和VSMC凋亡的相關基因和通路，再采用體外研究的方法，探索心痛泰含藥血清抑制PI3K/Akt/HIF-1α信號通路及凋亡相關因子的表達情況，從分子生物學水平證實心痛泰對易損斑塊中VSMC凋亡的具體作用機制。本研究結果提示，ox-LDL可模擬易損斑塊中VSMC凋亡的細胞模型，模型細胞的VSMC凋亡數量和凋亡率顯著增加。CCK8法篩選出心痛泰作用于實驗兔VSMC的最佳含藥血清為20%中濃度含藥血清。與模型組相比，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組的斑塊內PI3K/Akt/HIF-1α通路的基因與蛋白表達降低，其下游的凋亡相關因子caspase-3、caspase-9的表達明顯下降。TUNEL染色顯示，與模型組相比，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組的VSMC凋亡陽性細胞百分比明顯減少。流式細胞學結果表明，與模型組相比，心痛泰含藥血清組、LY294002組、心痛泰含藥血清+LY294002組的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均下降；與心痛泰含藥血清組相比，心痛泰含藥血清+LY294002組改善VSMC凋亡的效果無明顯差異，本次研究結果并未發現心痛泰含藥血清與LY294002疊加使用能產生協同抗凋亡效果，分析原因可能是在本研究中，心痛泰含藥血清和LY294002均已達最大抗VSMC凋亡作用，疊加使用并不優于單一含藥血清和單一LY294002的抗凋亡的效果，說明心痛泰含藥血清可能具有LY294002的類似作用，通過抑制PI3K/Akt/HIF-1α通路來減輕兔VSMC凋亡。

綜上，心痛泰含藥血清可通過抑制PI3K/Akt/HIF-1α通路及caspase-3、caspase-9從而減輕ox-LDL誘導的VSMC的凋亡，有助于維持VSMC結構和功能，這可能是心痛泰穩定斑塊纖維帽的潛在機制之一，為心痛泰穩定易損斑塊提供了體外研究依據。然而，本研究尚有不足之處，例如需進一步完善心痛泰含藥血清的質譜分析，研究心痛泰對人體斑塊中的作用機制是否與細胞實驗的作用機制相吻合等。