超聲輔助提取黑芝麻油腳卵磷脂及其抗氧化活性研究

鄧勝國 ,黃 艷 ,姜紅宇 ,尹愛武 ,黃光文

(1.湖南科技學院 化學與生物工程學院,湖南 永州 425199; 2.湘潭醫衛職業技術學院 教務處,湖南 湘潭 411104)

0 引言

卵磷脂的來源廣泛,存在于動植物組織及器官中,具有延緩衰老、增強記憶力、降低膽固醇等藥理作用[1],已廣泛應用于食品、醫藥等行業[2,3].卵磷脂提取、分離制備的方法主要為酶水解提取法、膜分離法、有機溶劑萃取法等[3].超聲輔助提取法具有提取溫度低、提取時間短、操作簡單、提取效果好等優點,在天然活性物質的提取分離中應用越來越廣泛[4].目前對芝麻的研究工作主要集中于對芝麻油的開發利用,其榨油之后產生的油腳等副產品一般被當作廢棄物處理,綜合利用率低從而導致資源浪費和環境污染.相關研究[5]表明,芝麻油腳含有粗蛋白、磷脂、芝麻素等活性成分,如果能采用適當的技術對油腳中的活性物質進行回收利用和開發,既可有效提升黑芝麻加工附加值,又可為磷脂的開發利用提供新的植物資源.本研究擬進行超聲輔助乙醇溶液提取黑芝麻油腳卵磷脂的工藝及其抗氧化活性的探討,以期為其他天然油料作物加工副產品油腳活性成分的有效提取及應用提供一定的參考.

1 材料與儀器

黑芝麻(隆回縣綠之佳糧油商貿有限公司);DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,酷爾化學科技(北京)有限公司);丙酮、無水乙醇(AR,湖南匯虹試劑有限公司);卵磷脂標準品(美國sigma 公司);維生素C(AR,天津市天力化學試劑有限公司).

DZF 電熱真空干燥箱(鞏義市英峪高科儀器廠);SL3-120A 超聲清洗器(上海舍巖儀器有限公司);UV-2600 紫外可見分光光度計(尤尼科(上海)儀器有限公司);ZYI-9028 貝爾斯頓榨油機(德國貝爾斯頓電器有限公司);LC-RE-52A 旋轉蒸發器(上海力辰儀器科技有限公司).

2 試驗方法

2.1 卵磷脂標準曲線的繪制

參照文[6]和[7]方法并做適當改進.分別吸取一定體積的卵磷脂標準應用液 (濃度為5 mg/mL)于若干個50 mL 的容量瓶中,以95 %的乙醇定容,稀釋制備一系列不同濃度的卵磷脂標準測試液,靜置10 min 后于最佳檢測波長處分別測定其吸光度,以卵磷脂標準測試液的濃度為自變量(橫坐標)、吸光度為因變量(縱坐標)繪制標準曲線,如圖1 所示.并通過線性擬合得其回歸方程y=1.1759x-0.0038,R2=0.9990.

圖1 卵磷脂標準曲線

2.2 黑芝麻油腳卵磷脂含量的測定

以壓榨法制備的黑芝麻毛油為原料,采用水化脫膠處理制備獲得黑芝麻油腳.準確稱取定量的黑芝麻油腳,經濃縮脫水后轉移至錐形瓶中,加入丙酮萃取脫油,油層分離后于殘渣中加入一定體積分數的乙醇進行超聲輔助提取卵磷脂,提取液進行過濾,收集濾液,殘渣同法重復提取1次,過濾,濾液合并經濃縮并定容.接著取適量粗(定容)濾液置于25 mL 的比色管中,按2.1節中的方法步驟,測定樣品提取液的吸光度后計算出其濃度,再按下式計算樣品的卵磷脂得率:

其中C為黑芝麻油腳樣品提取液中卵磷脂的濃度(mg/mL);V為黑芝麻油腳樣品提取液的總體積(mL);m為黑芝麻油腳的重量(g).

2.3 黑芝麻油腳卵磷脂提取的單因素實驗

準確稱取黑芝麻油腳5.000g,經濃縮、萃取等預處理后進行超聲輔助提取.以卵磷脂得率為考核指標,研究不同體積分數的乙醇(80%、85%、90%、95%、100%)、不同料液比(1:4、1:6、1:8、1:10、1:12)、不同溫度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)、不同浸提時間(20 min、25 min、30 min、35 min、40 min)對提取效果的影響,分別確定乙醇體積分數、料液比、超聲溫度及超聲時間4 個單因素最適宜的取值.

2.4 黑芝麻油腳卵磷脂提取的正交實驗

根據上述單因素試驗的結果,選擇采用L9(34)的正交表考察料液比(A)、乙醇體積分數(B)、超聲溫度(C)、超聲時間(D)四個因素對卵磷脂得率的影響效果,從而確定卵磷脂的最佳提取工藝.黑芝麻油腳卵磷脂提取的正交實驗因素水平見表1.

表1 黑芝麻油腳卵磷脂提取的正交實驗因素水平

2.5 黑芝麻油腳卵磷脂的體外抗氧化活性實驗

參照文[8]方法并做適當改進.將最優工藝條件提取制備的粗卵磷脂進行稀釋得到不同濃度梯度的樣品液,實驗過程中采用等濃度的VC溶液進行空白對照.吸取2 mL不同卵磷脂濃度的樣品液,加入2mL 65 μmmol/L 的DPPH 乙醇溶液,混勻后室溫下置避光處靜置30 min,于517 nm 處測其吸光度,按下式計算DPPH 自由基的清除率:

其中A0為2.0 mL DPPH 溶液+2.0 mL 95% 乙醇的吸光值;Ai為2.0 mL DPPH 溶液+2.0 mL 樣品液的吸光值;Aj為2.0 mL 95% 乙醇+2.0 mL 樣品液的吸光值.

3 結果與分析

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 不同體積分數的乙醇對黑芝麻油腳卵磷脂得率的影響

由圖2 可知,乙醇的體積分數在80%～95%的區間時,卵磷脂得率隨著體積分數的增加而增加,原因可能是卵磷脂化學結構中包含有親脂性的脂肪烴基團及親水性的基團(磷酸和膽堿),乙醇的體積分數較低即溶液的含水量較高時,卵磷脂易吸水膨脹形成膠體物質導致其溶解性下降不易被提取,但隨著乙醇的體積分數不斷增加,其極性可能和卵磷脂的極性逐漸接近,故根據相似相溶原理其溶解度不斷增加.當乙醇的體積分數超過95%時,卵磷脂得率反而降低的原因可能是此時萃取溶劑的特性與卵磷脂的性質偏差過大,不利于卵磷脂的提取.因此選用體積分數為95%的乙醇作為萃取劑進行卵磷脂的超聲輔助提取較適宜.

圖2 不同體積分數的乙醇對黑芝麻油腳卵磷脂得率的影響

3.1.2 不同料液比對黑芝麻油腳卵磷脂得率的影響

由圖3 可知,隨著料液比的增加即乙醇溶液用量的增加,卵磷脂得率也呈現逐漸增加的變化趨勢,原因可能是增加乙醇溶液的用量之后,使得乙醇溶液與油腳的接觸更加充分,故卵磷脂被提取得更加充分.但是當料液比增加到1:12 時,卵磷脂得率的增加幅度趨于平緩,表明此條件下油腳中卵磷脂的提取量已經趨于平衡達到飽和,且后續萃取劑的回收利用成本增大,綜合考慮選用1:10 的料液比進行超聲輔助提取油腳中的卵磷脂較適宜.

圖3 料液比對黑芝麻油腳卵磷脂得率的影響

3.1.3 超聲溫度對黑芝麻油腳卵磷脂得率的影響

由圖4 可知,以40℃為分水嶺,隨著溫度的上升或者下降,卵磷脂得率均呈現降低的現象,原因可能是: 當超聲溫度較低時,分子運動較為緩慢,不利于卵磷脂從黑芝麻油腳中轉移進入乙醇溶液,故其得率較低;在一定范圍內隨著溫度的上升,分子動能增加,傳質阻力下降,有效促進了卵磷脂擴散進入乙醇溶液的速率,故其得率隨之提高;超聲溫度超過40℃,加之卵磷脂溶于乙醇系放熱反應等影響,可能導致部分卵磷脂的氧化及部分乙醇揮發而改變萃取劑的極性,最終出現卵磷脂得率隨溫度的升高而下降的變化趨勢.故黑芝麻油腳卵磷脂的超聲輔助提取溫度選擇40℃較適宜.

圖4 超聲溫度對黑芝麻油腳卵磷脂得率的影響

3.1.4 超聲時間對黑芝麻油腳卵磷脂得率的影響

由圖5 可知,超聲處理時間在20～35 min 之間時,卵磷脂得率隨著超聲處理時間的延長而逐漸提高.究其原因可能是油腳中物質的溶解擴散進入萃取溶劑需要一定的時間,故適當延長超聲處理的時間有利于乙醇溶液將卵磷脂提取出來.當超聲處理時間超過35 min 時,卵磷脂得率下降的原因可能是由于處理時間過長,導致部分乙醇揮發損失改變萃取劑的特性及其他雜質溶解轉入萃取劑中所致.因此,超聲處理的時間不宜過長,黑芝麻油腳卵磷脂的超聲輔助提取時間選擇35 min 較適宜.

圖5 超聲時間對黑芝麻油腳卵磷脂得率的影響

3.2 正交實驗結果

依表2 分析比較各影響因素的kij(正交表中第j列因素i水平所對應的試驗指標值之和的平均值),實際得到卵磷脂超聲輔助提取的最優工藝組合(A3B3C2D3)與由表2 直觀地找出卵磷脂提取的最佳水平組合(A3B3C2D1)不一致,故需做驗證實驗.在實際得到的最優水平組合條件下進行驗證實驗,得到卵磷脂得率(取3 次平行實驗結果的平均值)為11.98 %,高于表2 中A3B3C2D1的得率,表明A3B3C2D3是真正的黑芝麻油腳卵磷脂超聲輔助提取的最佳制備工藝組合.

表2 黑芝麻油腳卵磷脂超聲輔助提取的正交實驗結果

3.3 體外抗氧化活性實驗結果

由圖6可知,在一定濃度范圍內,卵磷脂粗提物對DPPH自由基的清除能力隨著其濃度的增加而增強,半數抑制濃度(IC50)值為0.46 mg/mL,表明黑芝麻油腳卵磷脂具有一定的抗氧化能力.相較于相同濃度下對照品維生素C,黑芝麻油腳卵磷脂對DPPH 自由基的清除效果總體上較弱,其原因可能是分離制備的卵磷脂純度不夠所致.

圖6 黑芝麻油腳卵磷脂對DPPH 自由基的清除作用

4 結束語

黑芝麻油腳卵磷脂超聲輔助提取的最優工藝條件為: 乙醇體積分數為95%,料液比為1:12,超聲溫度為40℃,超聲時間為40 min.在此最優工藝條件下,黑芝麻油腳卵磷脂得率為11.98%.

體外抗氧化實驗結果表明,黑芝麻油腳卵磷脂對DPPH 自由基具有一定的清除效果,IC50值為0.46mg/mL,比維生素C 清除DPPH 自由基的能力略弱.