飛秒激光小切口角膜基質透鏡取出術來源的角膜基質透鏡保存方法的研究進展

熊素雅, 王 寧, 白夢天, 康海軍, 林 莉,

(1. 成都中醫藥大學眼科學院, 四川 成都, 610075; 2. 四川省遂寧市中心醫院 眼科中心, 四川 遂寧, 629000)

角膜盲發病率高居中國致盲性眼病第2位,角膜移植手術是治療角膜盲的有效方法,但因角膜供體嚴重匱乏,許多角膜盲患者缺少重獲光明的機會,因此尋找新的角膜供體材料成為眼科界的關注熱點[1]。角膜基質透鏡是角膜組織的一部分,由有序排列的膠原纖維和角膜基質細胞組成,沒有血管和淋巴組織,可作為一種免疫排斥反應較小的角膜移植材料應用。研究[2-3]發現,飛秒激光小切口角膜基質透鏡取出術(SMILE)來源的角膜基質透鏡最大程度地保留了角膜組織的理化特性,學者們將其用來治療角膜潰瘍、圓錐角膜、角膜營養不良等眼科疾病,并證實其安全有效。因角膜移植術前需進行傳染病篩查、供體和受體需在同一天完成手術等因素限制,致使大多新鮮透鏡不能及時應用于臨床而被丟棄。故如何保存角膜基質透鏡,維持其膠原纖維結構完整性、透明度和降低免疫原性并延長其保存時間等,成為了研究熱點。本文就SMILE來源的角膜基質透鏡的保存方法的研究進展進行綜述。

1 超低溫冷凍保存

超低溫冷凍保存技術是指在活細胞、角膜組織或其他生物樣本中添加冷凍保護劑(如二甲亞砜、丙二醇和聚乙二醇等),使其在冷凍過程中免受或減少一系列低溫損傷(冰晶損傷、滲透損傷和溶質損傷等)的影響,并通過緩慢冷凍、快速冷凍或玻璃化方法將樣本降至超低溫(-80 ℃或-196 ℃)進行保存,在需要的時候,以適當的方法復溫、解凍,并去除冷凍保護劑進行使用[4-5]。在超低溫環境中,細胞生長活動及物質代謝幾乎停止,可避免代謝產物積聚所帶來的毒性作用,也可抑制微生物的生長繁殖,故超低溫冷凍保存法在醫學上運用廣泛[4]。有研究證實,超低溫冷凍保存角膜基質透鏡有效可行, MOHAMED-NORIEGA K等[6]將-80 ℃下保存1個月的透鏡和新鮮透鏡進行對比,發現2組的膠原纖維都保存完好,且存在有活性的角質細胞,2組中分離出的角質細胞進行體外培養后的細胞形態和增殖率沒有顯著差異,證實-80 ℃冷凍保存1個月的透鏡與新鮮角膜組織相似。韋琦等[7]對比觀察-80 ℃中保存1、24、60及84個月的透鏡,發現隨著保存時間延長,膠原排列逐漸紊亂、細胞變形皺縮明顯,但各組的透光率及凋亡率無顯著差異,說明-80 ℃可長期保存透鏡。不過該研究尚未明確透鏡膠原纖維結構發生變化的時間節點,以及缺乏將長期保存的透鏡用于臨床治療的相關研究。RIAU A K等[8]發現在-196 ℃下,短期(3個月)和長期保存(12個月)的透鏡較新鮮透鏡透明度顯著降低,之后將冷凍保存的透鏡植入兔角膜中,隨訪觀察16周發現2組均未出現明顯的不良反應及炎癥反應,且角膜透明度均接近術前,提示-196 ℃長期冷凍保存透鏡可行。研究[9-11]表明,植入經超低溫冷凍保存的透鏡或新鮮透鏡,在后期的傷口愈合過程并無顯著差異,證實再植入超低溫冷凍保存的透鏡治療部分眼部疾病安全有效。高穎等[12]將-80 ℃下保存30 d以上的透鏡用于治療3例角膜變性和2例角膜潰瘍患者,術后隨訪6個月,發現透鏡植片與植床均貼合良好,且植片保持透明,無感染及排斥反應等并發癥發生。上述研究均表明,將超低溫冷凍保存的角膜透鏡組織用于臨床安全可行,且能夠保持角膜組織的透明性。

但也有學者[13]提出,該技術本身會影響組織的微觀結構,對將超低溫冷凍保存的透鏡用于眼科疾病的治療存在疑慮,目前還缺乏關于移植角膜基質透鏡的遠期并發癥的相關研究。RIAU A K等[14]使用與MOHAMED-NORIEGA K等[6]相同的方法保存透鏡,發現1個月后透鏡出現組織水腫及清晰度降低,認為可能與透鏡內的液體平衡改變有關,同時將其植入靈長類動物眼中,出現短期角膜水腫,推測人類也可能會出現類似情況,故為避免此現象影響透鏡臨床應用,建議超低溫保存的時間盡量控制在1個月以內。此外,超低溫冷凍保存法所需設備昂貴、存儲過程復雜以及對技術人員要求高,導致該方法在基層醫院開展受限,因此需要優化透鏡的保存,以便提高透鏡的利用率。

2 介質保存

為降低保存透鏡的成本并優化存儲過程,有研究嘗試用角膜活性中期保存液(DX液)、甘油、硅油和變色硅膠等不同介質來保存角膜基質透鏡,并取得了良好效果,但不同保存介質各有優缺點,實際應用中可根據不同需求進行選擇。DX液由山東省眼科研究所自主研制,以細胞培養基為基礎液,添加了皮質類固醇,與Optisol液相比,配制簡單、價格低廉,可以降低角膜組織保存過程中的代謝,但有效期短(為配制后1周)[15]。甘油具有優異的脫水和抗菌特性,聯合低溫保存時,可維持組織的膠原板層結構并去除生物源性[16], 因此被認為是一種理想的透鏡保存介質,但較適合1個月內的短期保存。硅油具有無毒、不揮發、疏水性和化學性質穩定等一系列優異的理化性質,可以與外界環境達到很好的隔離效果,因此有研究[17]用硅油作為介質來保存透鏡,但存在從硅油取出透鏡洗滌時不易洗凈的問題。變色硅膠可去除角膜組織中的水分、防止細胞酶失活和抑制細胞自溶,從而保持角膜組織的完整性[18]。ROMANO V等[19]將在室溫下用硅膠保存2周的角膜基質復水后,發現基質透鏡仍保留其分子和生物力學特性,建議用此方法保存角膜內皮細胞計數低的供體或角膜內皮移植術等手術后剩余的角膜組織,以便后期用于深板層角膜移植術,從而增加角膜供體數量。

田樂等[16]對比觀察4 ℃ DX液與-20 ℃甘油保存透鏡的效果,發現DX液保存1周的透鏡膠原纖維排列規則致密、細胞結構完整,而甘油中保存1 d就出現基質組織水腫、細胞核裸露,1周后細胞分布稀疏、細胞結構不完整,說明在保存時間為1周內時,DX液在維持透鏡組織結構的完整性方面優于甘油。但以上研究僅進行了體外實驗且保存時間較短,在眼科疾病治療中的研究仍需進一步完善。LIANG G等[18]探索無水甘油、變色硅膠和Optisol培養基保存透鏡的效果,發現2周后, Optisol培養基組在保持基質細胞活性、透鏡透明度和結構完整性上優于無水甘油和變色硅膠,但Optisol培養基成本顯著高于無水甘油、變色硅膠,因而限制了其在臨床的廣泛應用。XIA F等[17]比較無水甘油、硅油和變色硅膠對透鏡透光率和超微結構的影響,發現3種保存介質均可用于透鏡保存,4周后硅膠在維持透鏡透光率方面效果更好,這與李文娟等[20]研究結果一致。然而該研究僅探索了透光率和超微結構變化,缺乏免疫原性和生物力學特性的相關研究。LIU Y C等[21]將透鏡分別在磷酸鹽緩沖液、DMEM、Optisol GS和無水甘油共4種介質中保存48 h,結果顯示,各組透鏡均保持較高的透明度、結構完整性和低免疫原性,說明在無法立即將透鏡進行長期儲存于大型實驗設備前,或轉運至基層醫院應用時,可用此法進行臨時保存48 h。研究[17-18]發現,甘油保存的透鏡表現出更嚴重的水腫和更稀疏的膠原排列,但LIU Y C等[21]將透鏡在甘油中保存時,發現透鏡仍保持良好膠原纖維排列,XIA F等[17]認為這可能與其研究中相對較短的保存時間有關。

Optisol液因成本、來源和保存期等因素限制,目前在中國難以廣泛應用,而甘油成本低且室溫保存時能保持透鏡透明度和超微結構特征,在低溫下比Optisol液更具優勢[22]。

3 超低溫冷凍聯合介質保存

盡管角膜被認為是相對免疫赦免的器官,但角膜基質透鏡移植仍存在排斥風險,為探索降低抗原性的有效保存方法,許多學者借助角膜保存液、硅油、甘油等不同介質聯合超低溫冷凍技術來保存透鏡[23]。SHANG Y F等[24]將透鏡分為新鮮組、-78 ℃無水甘油保存組和0.1%十二烷基硫酸鈉脫細胞組進行免疫組化、透光率檢測及透射電鏡觀察,結果表明,-78℃無水甘油保存是減少抗原性而不破壞透鏡結構和光學性能的理想方法。相關研究[25]將透鏡置于室溫和4、-20、-80 ℃的無水甘油中保存3個月,發現-80 ℃組的透光率接近于新鮮透鏡且抗原性減少,而其他組的透光率均顯著降低,提示-80 ℃無水甘油中保存為最佳方法。薛春燕等[26]用-80 ℃無水甘油中保存的透鏡治療5例角膜潰瘍穿孔患者,發現僅1例真菌性角膜潰瘍患者在術后1個月因植片融解壞死,而更換了新的植片,其余患者創面均愈合良好; 此外,劉嫻[27]用-80 ℃無水甘油中保存的透鏡聯合羊膜移植治療14例真菌性角膜潰瘍患者,其術后潰瘍炎癥消退、前房形成良好,雖然隨訪時,此研究中多數植片處于半透明狀,但其可有效控制炎癥進展,并為后期光學性角膜移植創造條件。上述研究表明, -80 ℃下無水甘油保存的透鏡單獨或聯合羊膜應用治療角膜潰瘍的短期療效是安全可靠的。雖然許多研究證實,超低溫冷凍聯合介質保存法較單純超低溫冷凍保存及介質保存法能有效降低透鏡的免疫原性,并在維持透鏡透光率和膠原纖維結構完整性方面具有優勢,但這些研究存在樣本量較小且隨訪時間較短等局限,還需擴大樣本量及延長隨訪時間觀察遠期療效,以為臨床應用提供參考。

4 去細胞化保存

有研究利用物理、化學和輻射等方法去除透鏡的細胞成分,消除其免疫原性的同時保留細胞外基質,然后在室溫下長期儲存于角膜基質透鏡庫特定介質中,在需要時運送至醫院使用,另有研究表明在透鏡移植后受體自身的細胞會逐漸遷移植入透鏡中,進一步揭示了去細胞化法在臨床應用中的可行性[28-29]。去細胞化法因可降低透鏡免疫原性和便于長期保存等優勢極大提高了透鏡的臨床應用潛力,可能是透鏡保存的研究熱點。但該方法過程復雜,設備要求高,暫未廣泛使用而且在中國一些患者無法負擔其費用。盡管如此,隨著醫學技術的更迭,未來去細胞化法保存透鏡仍將有廣闊的發展前景。

5 營養膠囊保存

近期, ZHAO J等[30]受天然人類淚膜成分的啟發,構建了1種能夠維持淚膜穩態的營養水凝膠膠囊,用于中期保存角膜基質透鏡,最長保存長28 d后,營養膠囊組活細胞比例、透光率及膠原纖維數量均高于傳統甘油組,且膠原纖維排列更為整齊規律,目前該技術已成功應用于臨床。在人類同種異體移植研究中,植入的透鏡無排斥反應且保持透明,術后70%的患者矯正遠視力有所提高,營養膠囊保存為透鏡及其他活體組織的保存與臨床再利用帶來了新的可能。

6 總結與展望

人角膜基質透鏡的再利用為角膜疾病的治療提供了新思路。研究表明,當條件允許時,可選擇超低溫冷凍聯合介質保存法,其可降低透鏡免疫原性并可長期保存。在設施不完善的情況下,介質保存(如DX液、甘油、硅膠等)仍是首選方法,去細胞化法及營養膠囊保存法目前未能廣泛使用,但隨著制備工藝的精進與簡化,去細胞化法及營養膠囊保存法有望成為透鏡保存的理想方法。目前,尚無可以完全滿足臨床需求的保存方法,因此需要更多的臨床實驗研究,探討可長期保存且能維持角膜透鏡特性及運輸方便、技術簡單且費用低廉,并適合中國現階段角膜基質透鏡庫和醫療情況的保存方法。相信隨著更全面、深入的研究和更多規范化角膜基質透鏡庫的運行, SMILE來源的角膜基質透鏡將會得到更好的再利用,從而為角膜病患者帶來光明與希望。