艷錦竹芋葉斑病病原菌的分離與鑒定

張徐玥，宋蘊哲，李悅悅，聶傳朋，李焰焰，蔡普默

（武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300）

艷錦竹芋（Stromanthe sanguinea Triostar）又名三色竹芋、艷錦密花竹芋等，是竹芋科（Marantaceae）紫背竹芋屬（Stromanthe）的多年生草本植物[1]。艷錦竹芋原產(chǎn)于巴西，我國均有栽培，主要在南方地區(qū)。因其株型端正美觀，葉面上絢麗多彩的斑紋深受人們喜愛，具有較高的觀賞價值，是近年來流行的主要觀葉植物之一[2]，目前被廣泛應(yīng)用于園林綠化中[3]。

竹芋科植物在生產(chǎn)栽培中，其葉部極易出現(xiàn)葉斑或葉枯等病害，影響植物的觀賞價值，嚴(yán)重時植株容易出現(xiàn)死亡[4-8]。近幾年，竹芋科植物在觀葉植物的應(yīng)用熱潮中脫穎而出，我國引種品種和栽植面積都有所增加，然而病蟲害問題日益嚴(yán)重，不少學(xué)者逐漸展開對竹芋科植物病害的研究。例如，2019 年吳碧云報道紫背竹芋炭疽病的病原菌為暹羅炭疽（Colletotrichum siamense）[9]；2020 年趙京鵬報道孔雀竹芋基腐病的病原菌為天南星麗赤殼（Calonectria spathiphylli），為國內(nèi)首次報道[10]；2021 年陳燦鈿等鑒定青蘋果竹芋葉斑病的病原菌為平臍蠕孢（Bipolaris sivanesaniana），亦為首次報道[11]。我國引種竹芋科植物的歷史不長，對其病害的研究較少[8,12]，而明確其病原菌種類是開展針對性病害防治及保障其安全生產(chǎn)的基礎(chǔ)。

以福建省武夷山市武夷學(xué)院園藝大棚內(nèi)采集的患葉斑病艷錦竹芋葉片為試驗材料，通過對病原菌的分離純化，對其進(jìn)行致病性測定、形態(tài)學(xué)觀察及分子鑒定，并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，對引起艷錦竹芋葉斑病的病原菌進(jìn)行鑒定，旨在為艷錦竹芋葉斑病的診斷及防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 艷錦竹芋病害癥狀觀察與病葉采集

2021 年5 月，在福建省武夷山市武夷學(xué)院園藝大棚內(nèi)對艷錦竹芋病癥進(jìn)行觀察拍照，并采集病葉作為試驗樣品。

1.2 病原菌的分離、純化及保存

參考方中達(dá)的常規(guī)組織分離法分離出病葉樣品的病原菌并純化[13]。將病葉樣品用無菌水沖洗干凈后，在超凈工作臺里切取若干塊2 mm×2 mm 病健交界處的病葉組織，用75%酒精浸泡30 s 消毒后，無菌水沖洗3 次，風(fēng)干后放置在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)。7 d 后挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于PDA 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)3 次。純化后的菌絲塊（Φ5 mm）放在裝有無菌水的10 mL 離心管中，置于-4 ℃冷凍保存。

1.3 病原菌的致病性測定

采用菌絲塊針刺接種法，進(jìn)行離體和活體兩種接種方式[13]，用75%酒精和無菌水消毒健康葉片，在每片葉片上接種1 處（每處穿刺5 個小孔）。在菌落邊緣切取菌絲塊（Φ5 mm），菌絲面貼合接種處，覆蓋濕棉球保濕。離體接種葉片置于培養(yǎng)皿內(nèi)潤濕的濾紙上，用濕棉球包裹葉片基部保濕。活體接種每盆植株用透明塑料袋隔絕污染，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)，按日常方法管理。用無菌PDA 培養(yǎng)基塊（Φ5 mm）做空白對照，每個處理3 次重復(fù)。接種后，觀察記錄葉片發(fā)病情況。

1.4 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

觀察菌株在PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d 的菌落，測量菌落直徑，觀察記錄菌落形態(tài)特征。觀察顯微形態(tài)使用插片法誘導(dǎo)產(chǎn)孢，將有分生孢子的蓋玻片制成臨時裝片，在Nikon 相差倒置顯微鏡（Eclipse Ts2，成貫儀器（上海）有限公司）下觀察其孢子大小、形狀、產(chǎn)孢細(xì)胞形狀和產(chǎn)孢方式，并對其形態(tài)進(jìn)行顯微拍照。

1.5 病原菌的分子鑒定

將純化的菌株接種至新PDA 培養(yǎng)基中，待菌絲長滿培養(yǎng)基，刮取適量菌絲體，采用液氮研磨樣本。使用真菌基因組DNA 抽取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取純化菌株的DNA，-20 ℃保存。1%瓊脂糖檢測合格后進(jìn)行ITS-PCR 擴(kuò)增，引物選用ITS1/ ITS4（TCCGTAGGTGAACCTGCGG/ TCCTCCGCT TATTGATATGC）（引物由上海派森諾生物科技有限公司合成）。PCR 反應(yīng)體系為10 μL 2×Taq PCR Master Mix 溶液、12 μL ddH2O、2 μL DNA、1 μL 上游引物和1 μL 下游引物。PCR 擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃總延伸7 min，16 ℃保存。對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，后回收PCR 產(chǎn)物進(jìn)行DNA 測序（由上海派森諾生物科技有限公司完成）。測序結(jié)果提交到國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），后用NCBI Blast 程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄信cNCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，從中下載8 株序列相似性高的菌株序列，并以Erysiphales sp.作為外源序列，運用MEGA11 軟件，根據(jù)鄰位歸并（Neighbor-Joining，NJ）法，并用Bootstrap 1000 次進(jìn)行檢驗，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

1.1 艷錦竹芋病害癥狀

葉片內(nèi)部有不規(guī)則小病斑，病健交界明顯，內(nèi)部發(fā)白，邊緣為黃褐色，病斑邊緣具明顯的褐色線紋。葉片正反面均大量散生大小不等的黑褐色近圓錐形粒狀凸起，以葉面為主，牢牢附著在葉片上，中心為淺褐色。新生葉片無病斑，葉面上散生大量小粒狀凸起（圖1）。

圖1 艷錦竹芋葉斑病癥狀Fig.1 Symptoms of leaf spot disease of Stromanthe sanguinea ‘Triostar’

1.2 病原菌的致病性測定

將分離純化后的菌株進(jìn)行致病性測定，其中菌株YJ-2 發(fā)病情況與病葉樣品內(nèi)部小病斑相符，活體葉片發(fā)病較明顯，初期在打孔點邊緣小范圍開始發(fā)病，形成干枯發(fā)黃的病斑；后期病斑蔓延融合，形成邊緣明顯、內(nèi)部發(fā)白的塊斑（圖2）。離體接種和活體接種均未出現(xiàn)黑褐色凸起小顆粒。

圖2 菌株YJ-2 的致病性測定Fig.2 Pathogenicity determination of strain YJ-2

1.3 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

菌株YJ-2 在PDA 培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d 后，菌落直徑約75 mm，菌落輻射狀生長，出現(xiàn)深淺相間的輪紋，邊緣呈花瓣狀；中心處菌絲為白色致密的絨絮狀，邊緣氣生菌絲平鋪（圖3-a）；15 d 后，菌落出現(xiàn)黑色點狀的分生孢子器，排列在同心圓的邊緣，外緣出現(xiàn)黃色小點（圖3-c）；菌落背面顏色漸深呈灰褐色的不規(guī)則同心環(huán)（圖3-d）。菌絲呈直角狀分枝（圖3-e）；分生孢子梗細(xì)長分枝，少數(shù)不分枝或簇狀，生出內(nèi)壁芽生瓶梗型產(chǎn)孢細(xì)胞（圖3-f）；α 型分生孢子卵圓形至長橢圓形單孢，孢子兩端多有兩個大油球，少數(shù)為1或3 個（圖3-g）；β 型分生孢子線型，多為筆直，有的稍彎曲或彎曲呈鉤狀，單孢，內(nèi)無油球，無隔膜（圖3-h）。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，初步鑒定為擬莖點霉屬菌（Phomopsis sp.）。

圖3 菌株YJ-2 的形態(tài)學(xué)觀察Fig.3 Morphological observation of strain YJ-2

1.4 病原菌的分子鑒定

拼接測序結(jié)果得出，菌株YJ-2 序列長度為530 bp（圖4）。拼接后序列與NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST 比對，結(jié)果顯示菌株YJ-2（登錄號ON899814）和NCBI 數(shù)據(jù)庫中擬莖點霉屬菌Phomopsis sp.（登錄號DQ780431.1）的相似性達(dá)99.43%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，菌株YJ-2 與Phomopsis sp.聚為一支，置信值為97%（圖5），親緣關(guān)系比較近，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，將菌株YJ-2 鑒定為擬莖點霉屬菌（Phomopsis sp.）。

圖4 菌株YJ-2 部分測序峰圖（320bp-390bp）Fig.4 Partial sequencing of strain YJ-2 (320bp-390bp)

圖5 基于ITS 序列構(gòu)建的菌株YJ-2 與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain YJ-2 and related strains based on ITS sequences

3 討論與結(jié)論

以武夷學(xué)院園藝大棚內(nèi)患葉斑病艷錦竹芋的病葉為試驗材料，通過對病原菌的分離純化，將得到的菌株進(jìn)行致病性測定，并對其形態(tài)學(xué)觀察、分子鑒定，并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，確定菌株YJ-2 為擬莖點霉屬菌，是該病株艷錦竹芋葉斑病的致病菌。

擬莖點霉屬是半知菌類、腔孢綱、球殼孢目，有性態(tài)為間座殼屬（Diaporthe）[14]，該屬寄主范圍廣，為害多種植物，其中包含一些觀賞類植物，如竹芋科、棕櫚科、鳳梨科等[15-17]。擬莖點霉屬的種級分類至今沒有明確提出，如今還是主要依據(jù)寄主來劃分，寄生在同屬植物上且形態(tài)一致的菌可以劃分為一個種；寄生在不同屬植物上形態(tài)相似的卻被劃分為另一個種[18]。2008 年曾莉等曾研究發(fā)現(xiàn)擬莖點霉（Phomopsis marantaceae）可引起竹芋擬莖點霉葉斑病，危害多種竹芋，但未發(fā)現(xiàn)危害艷錦竹芋，試驗病株的病癥與其描述的一致[8]。

僅對艷錦竹芋葉斑病的一種致病菌進(jìn)行分離和初步鑒定，今后應(yīng)深入開展發(fā)病規(guī)律、孢子萌發(fā)條件、致病機(jī)理、病原菌與宿主之間關(guān)系等研究，并對鑒定的致病菌進(jìn)行生防制劑的篩選，掌握更多的病害發(fā)生信息，為今后竹芋科觀葉植物的病害防治提供一定的參考和理論依據(jù)。