子宮內膜癌患者NLRC5與自噬蛋白表達的相關性及其臨床意義*

李燕，李從青，何閏華，衛兵

（安徽醫科大學第二附屬醫院 婦產科，安徽 合肥 230601）

子宮內膜癌是發生于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，也是女性生殖道常見的三大惡性腫瘤之一。根據流行病學統計，子宮內膜癌多發于圍絕經期及絕經后女性，近年來發病率持續上升，且呈年輕化趨勢[1-2]。目前，針對子宮內膜癌患者的治療仍以手術為主，同時輔助放化療，但對晚期患者的療效仍然有限，且預后相對較差[3-4]。目前，臨床認為影響子宮內膜癌患者預后的因素主要為病理類型、淋巴轉移、肌層浸潤深度等，而隨著近年來進一步研究發現，NLR家族含CARD結構域5（NOD-like receptor family caspase activation and recruitment domain containing 5,NLRC5）在腫瘤的發生、發展中扮演重要角色，且可能與疾病的預后密切相關[5]。NLRC5是近年來新發現的NLR樣受體家族中的受體之一，通過干擾素（Interferon,IFN）和核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）分別與NLRC5的啟動點相結合，可發揮NLRC5在細胞與細胞核之間穿梭的特性，增加了調控功能和范圍[6]。自噬是人體自我保護機制，在內環境穩態及細胞器與蛋白質質量控制上具有一定意義，若缺乏或過度激活則可導致一系列病理系反應[7]。已有文獻證實，自噬與子宮內膜癌的發病關系密切，但其與子宮內膜癌預后的相關性仍未完全明確[8]。基于此，本研究探討子宮內膜癌患者NLRC5表達與子宮內膜癌患者自噬相關蛋白Beclin1、LC3表達的相關性，并探討NLRC5、Beclin1、LC3與子宮內膜癌預后的相關性，旨在為子宮內膜癌預后制訂相關防治方案提供參考意見。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—2022年1月安徽醫科大學第二附屬醫院90例子宮內膜癌患者的癌組織作為子宮內膜癌組，另取90例正常子宮內膜作為子宮內膜組。子宮內膜癌組平均（61.03±5.27）歲，平均體質量指數（22.98±1.03）kg/m2；正常子宮內膜組平均（60.74±5.15）歲，平均體質量指數（23.17±1.01）kg/m2。兩組的年齡、體質量指數比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。納入標準：①符合子宮內膜癌診斷標準[9]，且經組織病理學檢查確診；②FIGO分期為Ⅰ～Ⅲ期；③入組前均未接受過相關放化療等治療；④接受腹腔鏡手術治療；⑤患者及家屬簽署知情同意書。正常子宮內膜組均經宮腔鏡取組織活檢病理診斷為正常子宮內膜組織標本。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并凝血功能障礙；③合并多臟器功能不全；④有精神及認知功能障礙無法交流或配合。本研究已獲醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA表達

收集90例子宮內膜癌患者癌組織與正常子宮內膜標本組織。按照mRNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說明書步驟提取組織總mRNA，使用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA。以逆轉錄的cDNA為模板，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA的表達。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火40 s，72℃延伸90 s，共循環45～50次；72 ℃延伸5 min。在擴增反應結束后，采用2-ΔΔCt法計算NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA相對表達量。NLRC5正向引物：5'-CTATCAACTGC CCTTCCACAAT-3'，反向引物：5'-TCTCTATCTGCC CACAGCCTAC-3'，引物長度2 000 bp；Beclin1正向引物：5'-AGCACCATGCAGGTGAGCTT-3'，反向引物：5'-TGACACGGTCCAGGATCTTG-3'，引物長度929 bp；LC3正向引物：5'-AGCAGCATCCAACC AAATC-3'，反向引物：5'-CTGTGTCCGTTCACCAAC AG-3'，引物長度119 bp。以GAPDH為內參，正向引物：5'-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3'，反向引物：5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3'，引物長度80～160 bp。

1.3 預后分組

術后對90例子宮內膜癌患者進行12個月的隨訪，按照實體瘤RECIST 1.0標準[10]：完全緩解為所有可測量病灶完全消失，且維持時間> 4周；部分緩解為各病灶最大徑之和橫徑乘積減少≥50%，且維持時間> 4周；病情穩定為各病灶最大徑乘積總和減少未超過50%或增大未超過25%，且維持時間>4周；病情進展各病灶最大徑乘積總和增大超過25%，有新的病灶出現。完全緩解、部分緩解、病情穩定為預后良好，病情進展為預后不良。將子宮內膜癌患者根據預后情況分為預后不良組與預后良好組。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson法；影響因素的分析采用多因素一般Logistic回歸模型；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic curve,ROC）曲線。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜癌與正常子宮內膜NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA相對表達量比較

子宮內膜癌組與正常子宮內膜組的NLRC5、Beclin1和LC3 mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；子宮內膜癌組NLRC5 mRNA相對表達量較正常子宮內膜組低（P<0.05），Beclin1和LC3 mRNA相對表達量較正常子宮內膜組高（P<0.05）。見表1。

表1 子宮內膜癌組與正常子宮內膜組NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA相對表達量比較 （n =90，±s）

表1 子宮內膜癌組與正常子宮內膜組NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA相對表達量比較 （n =90，±s）

組別子宮內膜癌組正常子宮內膜組t 值P 值NLRC5 mRNA 0.49±0.10 1.00±0.12 30.974 0.000 Beclin1 mRNA 1.72±0.10 1.00±0.08 53.337 0.000 LC3 mRNA 1.58±0.08 1.00±0.15 32.367 0.000

2.2 NLRC5與Beclin1、LC3的相關性分析

NLRC5與Beclin1（r=-0.565，P=0.014）、LC3（r=-0.421，P=0.031）呈負相關；Beclin1與LC3呈正相關（r=0.462，P=0.025）。

2.3 預后良好組與預后不良組的臨床資料比較

根據12個月的隨訪結果，預后良好的72例（80.00%）納入預后良好組。預后良好組與預后不良組的年齡、體質量指數、脈管浸潤、腫瘤直徑比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。預后良好組和預后不良組的FIGO分期、宮體肌層深肌層占比、淋巴結轉移、Beclin1、LC3、NLRC5 mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；預后不良組的FIGO分期、宮體肌層深肌層占比、淋巴結轉移、Beclin1 mRNA、LC3 mRNA相對表達量高于預后良好組，NLRC5 mRNA相對表達量低于預后良好組。見表2。

表2 預后良好組與預后不良組的臨床資料比較

2.4 子宮內膜癌預后影響因素的多因素一般Logistic回歸模型分析

以預后為因變量，以FIGO分期、宮體肌層、淋巴結轉移及NLRC5、Beclin1、LC3為自變量（賦值見表3），進行多因素一般Logistic回歸分析（引入水準為0.05，排除水準為0.10），結果顯示：FIGO分期Ⅱ、Ⅲ期[=3.760（95% CI：1.260，11.223）]、宮體肌層深肌層[=26.800（95% CI：7.043，101.984）]、有淋巴結轉移[=11.324（95% CI：3.286，39.019）]及Beclin1 [=68.163（95% CI：2.537，643.326）]、LC3 [=26.468（95% CI：1.444，485.127）]均是子宮內膜癌預后的危險因素（P<0.05）；NLRC5 [=0.001（95% CI：0.000，0.079）]為保護因素（P<0.05）。見表4。

表3 賦值表

表4 子宮內膜癌預后影響因素的多因素一般Logistic回歸分析參數

2.5 子宮內膜癌NLRC5、Beclin1、LC3表達對預后的預測價值

將NLRC5、Beclin1、LC3作為檢驗變量，將子宮內膜癌預后作為狀態變量（0 =預后良好，1 =預后不良），繪制ROC曲線，結果顯示，NLRC5的曲線下面積（area under the curve,AUC）為0.790（95% CI：0.652，0.929）、敏感性為82.8%（95% CI：0.784，0.923）、特異性為73.9%（95% CI：0.670，0.938）；Beclin1的AUC為0.742（95% CI：0.625，0.858）、敏感性為56.8%（95% CI：0.638，0.853）、特異性為77.8%（95% CI：0.644，0.877）；LC3的AUC為0.678（95% CI：0.546，0.810）、敏感性為57.3（95% CI：0.680，0.815）、特異性為72.2%（95% CI：0.693，0.824）；聯合檢測的AUC為0.887（95% CI：0.812，0.963）、敏感性為94.4%（95% CI：0.824，0.971）、特異性為62.5%（95% CI：0.593，0.778）。見表5和圖1。

圖1 NLRC5、Beclin1、LC3表達預測子宮內膜癌患者預后的ROC曲線

表5 子宮內膜癌NLRC5、Beclin1、LC3表達對預后的預測效能

3 討論

我國流行病學統計，子宮內膜癌的發病率已成為僅次于宮頸癌的第二大常見婦科惡性腫瘤，約占全部婦科惡性腫瘤的20%～30%，嚴重威脅世界女性的健康[11]。近年來，隨著治療方案不斷更新，子宮內膜癌的治療效果明顯改善，大部分早期患者手術治療可有效得到根治，但晚期患者的生存率仍然較低。有研究表明，子宮內膜癌的治療效果受到局部病灶未得到有效控制、遠處轉移、復發等諸多因素的影響，另外浸潤深度、腫瘤體積、淋巴結轉移等也是導致預后不良的因素[12-13]。但上述因素仍無法準確評估預后，對指導臨床預后價值較低。因此，尋找影響子宮內膜癌的相關分子生物學特征，研究新型腫瘤分子標志物對判斷患者預后、制訂治療方案等具有重要意義。

NLRC5又稱MHCⅠ類反式激活因子（class I trans-activator,CⅠTA），是MHCⅠ類抗原提呈通路的主要轉錄激活因子，該基因定位于人類基因組的16q13，編碼1 886個氨基酸，結構由3個區域組成，分別為C端亮氨酸重復（leucine-rich repeats,LRRs）區、NATCH區和N短的DD區。NLRC5基因功能缺失會影響MHCⅠ類基因的表達，導致CD8+T細胞無法有效活化，從而發生腫瘤細胞免疫逃逸。ZHAN等[14]相關研究發現，NLRC5與腫瘤抗原遞呈密切相關，NLRC5表達缺失可導致子宮內膜癌患者NLRC5介導的自噬免疫逃避。SHUKLA等[15]研究亦發現，NLRC5是MHCⅠ類基因與APM基因的關鍵轉錄激活因子，NLRC5遺傳損傷與表觀遺傳修飾是癌癥中MHCⅠ缺陷的常見原因，均可說明NLRC5與癌癥的發生、發展密切相關。本研究結果顯示，子宮內膜癌組NLRC5表達較正常子宮內膜組低，且預后不良組的NLRC5表達低于預后良好組，NLRC5表達與Beclin1、LC3呈負相關，可見NLRC5低表達可能參與子宮內膜癌的發生與不良預后，且與自噬相關蛋白表達有關。分析原因可能是NLRC5受自噬調節，而自噬作為保守溶酶體降解途徑，在該過程中細胞內物質可被降解與再循環。通過維持機體細胞代謝的平衡，可改善細胞的生存環境，阻斷機體DNA突變，從而達到抑制癌細胞的作用。另外，自噬負責降解體內的毒性物質及相關分解產物，并再次利用，進而達到抑制癌細胞的效果。國外學者研究證實，自噬與炎癥密切相關，在炎癥相關的疾病中自噬發揮調控作用，在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等癌癥中可抑制腫瘤的發生[16]。

LC3主要負責形成自噬體的雙膜延伸，在機體中以可溶性形式（LC3-Ⅰ）與膜結合形式（LC3-Ⅱ）存在，而其中LC3-Ⅱ是公認的最可靠自噬生物標志物[17]。Beclin1是自噬體形成過程中的重要分子之一，其可介導其他自噬蛋白定位于吞噬泡，對哺乳動物自噬體的形成與成熟起到關鍵的調控作用。Beclin1-P13KC3復合體利于吞噬泡聚集與組裝，同時還可募集Atg16L等多聚體及LC3，利于促進吞噬泡的伸展擴展，使吞噬泡膜逐漸發展為環狀結構。與傳統抑癌基因相比，Beclin1基因僅在雙等位染色體共同表達時才可發揮抑癌作用。LI等[18]研究發現，Beclin1可與E3泛素連接酶（Cullin 3,CUL3）相互作用，促進K48連接的泛素化與蛋白降解，另通過下調Beclin1蛋白表達可引起自噬活性下降。ZHU等[19]研究亦表明，Beclin1過表達說明自噬活性增強，而Atg5敲除后可增加Beclin1表達，從而對細胞增殖起到抑制作用，進一步誘導細胞的凋亡。本研究結果顯示，子宮內膜癌組Beclin1、LC3表達較正常子宮內膜組高，且在預后不良組Beclin1、LC3也呈高表達，分析其原因可能如下：①自噬細胞通過對細胞異常增殖的抑制，可阻礙癌癥的發生及進展。自噬可通過調節細胞周期的變化，改變細胞的增殖，使異常增殖的細胞停止細胞分裂。②自噬作為腫瘤的抑制與啟動因子，其主要作用受到疾病類型、分期、腫瘤微環境等因素的影響。自噬水平的降低可促進腫瘤早期的癌細胞增殖，相反高表達可去除毒性成分，并提供循環生長因子，延長腫瘤微環境中癌細胞的生存時間[20]。

本研究多因素一般Logistic回歸分析結果顯示，FIGO分期Ⅱ、Ⅲ期，分化程度低中分化，宮體肌層深肌層，有淋巴結轉移均為子宮內膜癌預后不良的危險因素，與周露秋[21]等研究結果相似。本研究中ROC曲線分析結果顯示，子宮內膜癌NLRC5、Beclin1、LC3及3者聯合預測子宮內膜癌預后不良的AUC為0.790（95% CI：0.652，0.929）、0.742（95% CI：0.625，0.858）、0.678（95% CI：0.546，0.810）、0.887（95% CI：0.812，0.963），提示臨床可監測癌組織中NLRC5與自噬相關蛋白的表達，并采取針對性防治措施，以改善預后。

綜上所述，子宮內膜癌患者NLRC5呈低表達，NLRC5與自噬相關蛋白Beclin1、LC3呈負相關，3者聯合檢測可提高子宮內膜癌患者的預后預測價值。