溫度和精氨酸對羅氏沼蝦氨基脲檢出量的影響

高芳芳,王迪,陳勝軍,馮陽,鄧建朝,潘創,李春生

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(中國水產科學研究院南海水產研究所,國家水產品加工技術研發中心/農業農村部水產品加工重點實驗室,廣東 廣州,510300)

硝基呋喃是一類具有明顯殺菌消毒作用的廣譜抗生素藥物,廣泛用于畜禽和養殖水產品的衛生消毒處理[1]。呋喃西林 (nitrofurazon, NFZ) 是硝基呋喃的一種,其在動物體內代謝迅速,主要代謝物氨基脲 (semicarbazide, SEM) 與動物體內的蛋白質結合后形成穩定的化合物長時間存在于體內,具有潛在的致畸、致癌和致突變性[2-3]。歐盟于1995年禁止NFZ用于動物源食品[4],隨后中國、日本、美國等國家發布相同禁令,中國于2003年公布動物源性食品中SEM的最大殘留量是1.0 μg/kg,一些國家殘留限量是0.5 μg/kg[5-6]。水產品養殖過程中NFZ的違規使用通常通過檢測SEM來確定。研究發現,甲殼類水產品中SEM的檢出不僅是外源物質NFZ的代謝產生,還與加工過程及甲殼類水產品自身某些內源性物質有關[7-8]。2003年,SAARI等[9]在野生克氏原螯蝦 (Procambarusclarkii) 中檢測到SEM的存在,最高檢測量達12 μg/kg,首次提出甲殼類水生動物內源產生SEM這一觀點。MCCRACKEN等[10]對孟加拉國野生淡水明蝦 (Macrobrachiumagwi) 研究發現,不同水域蝦體中SEM普遍存在,并且蝦殼中的SEM檢出量是蝦肉中SEM檢出量的幾十倍不等,這與VAN等[11]、王鼎南等[12]、倪永付等[13]檢測結果一致。彭婕等[14]在中華絨螯蟹 (Eriocheirsinensis) 脫殼后新長出的軟殼中檢測到了SEM而蟹肉中未檢出SEM,推測水生動物甲殼可能是其內源性SEM的主要來源。甲殼類水產品中內源性SEM的存在得到了大量研究的證實,但其生成機理缺乏直接有效的科學實驗依據。

近年來研究發現中華絨螯蟹(E.sinensis) 蟹殼中的內源性SEM的殘留水平與蟹殼中的蛋白質含量及水解氨基酸組成有關[15]。同時有學者研究發現甲殼類水產品在高溫下更容易生成SEM,溫度的高低與SEM的檢出量成正比關系[16]。深入探討甲殼類水產品中SEM的檢出與結合氨基酸的關系發現,精氨酸酶可將精氨酸水解為鳥氨酸和尿素進入尿素循環,而尿素和SEM在結構上有一定的相似性。NOONAN等[17]證實甲殼類水產品中含量最豐富的氨基酸是精氨酸。對此YU等[18]在凡納濱對蝦 (LitopenaeusvannameiBoone) 生長期間對參與尿素循環的相關物質含量進行檢測后認為蝦體內的精氨酸等物質通過尿素循環最終形成SEM。

為了進一步研究甲殼類水產品中內源性SEM的生成機理,本研究以羅氏沼蝦為研究對象,采用高效液相色譜質譜聯用,研究溫度對羅氏沼蝦SEM檢出的影響。根據羅氏沼蝦蛋白質及水解氨基酸等相關因素的分布規律,驗證精氨酸對羅氏沼蝦內源SEM生成的相關性,這對今后研究甲殼類水產品中內源SEM的生成機理具有重要研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅氏沼蝦成蝦采自廣東肇慶養殖基地,在整個養殖期間未曾添加NFZ藥物,采集一定數量后用便攜冰箱運回實驗室-80 ℃超低溫冷凍保存。樣品分析前自然解凍,將去除頭部組織(包括頭胸甲)的羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉分離,分別準確稱取蝦殼和蝦肉樣品2.00 g(精確到0.01 g)凍干處理48 h;分別準確稱取蝦殼和蝦肉樣品2.00 g(精確到0.01 g)于50、70、100、130、200 ℃下恒溫48 h烘干處理,每次處理做3個平行,再用微型粉碎機粉碎(蝦肉60 s;蝦殼120 s)。

氨基脲標準品(SEM)、氨基脲內標(SEM-15N2-13C),上海安譜璀世標準技術服務有限公司;甲醇、乙腈、正己烷和乙酸乙酯(質譜純),廣州化學試劑廠;2-硝基苯甲醛、二甲基亞砜、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉和鹽酸(分析純),廣州化學試劑廠;實驗用水為MiliQ超純水。

1.2 儀器與設備

TQ-S-MICEO高效液相色譜質譜聯用,美國Waters公司;BS 224S電子天平,德國賽多利斯公司;DZF6050真空干燥箱,上海精宏儀器有限公司;TDZ5-WS臺式低速離心機,長沙湘儀儀器有限公司;Alpha1-4冷凍干燥機,德國Christ公司;3K30臺式高速冷凍離心機,德國Sigma公司;THZ-82水浴恒溫振蕩器,金壇市精達儀器制造廠;N-EVAP24氮吹儀,美國Organomation公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 羅氏沼蝦SEM的測定[19]

1.3.1.1 樣品前處理

將粉碎后的樣品小心完整的移至50 mL離心管中,分別加入100 ng/mL內標工作液0.1 mL,0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液0.2 mL,蝦肉樣品中加入0.2 mol/L鹽酸溶液5 mL,蝦殼樣品中加入0.2 mol/L鹽酸溶液10 mL,渦旋15 min,在37 ℃、轉速200 r/min的恒溫水浴振蕩器,避光衍生16 h。

衍生后的樣品冷卻至室溫,加2～3 mL磷酸氫二鉀溶液,調pH至中性,加6 mL乙酸乙酯,渦旋15 min,4 200 r/min離心15 min,取上清液于10 mL離心管,重復提取操作1次,合并上清液,水浴40 ℃氮氣吹干。加0.1%甲酸水-乙腈1.5 mL復溶,正己烷1.5 mL除脂,渦旋10 min,10 000 r/min離心15 min,取下清液過0.22 μm濾膜,待測。

1.3.1.2 儀器工作條件[20]

a)色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)反相色譜柱;流動相:A為0.1%甲酸水+5 mmol/L甲酸銨溶液(質譜純),B為乙腈(質譜純);進樣量:5.0 μL;柱溫:35 ℃;流速:0.35 mL/min;梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Program of gradient elution

b)質譜條件

離子源:電噴霧電離正離子 (electrospray ionization positive ion, ESI+) 模式掃描;掃描方式:多反應監測 (multiple-reaction monitoring, MRM) 模式;噴霧電壓:3 500 V;毛細管電壓:1 000 V;離子源溫度:120 ℃;去溶劑溫度:600 ℃;去溶劑氣流:氮氣,流速1 000 L/h;錐孔氣流:氮氣,流速為50 L/h。母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量見表2。SEM衍生物總離子流圖及質譜圖見圖1。

A-總離子流圖;B-質譜圖圖1 SEM衍生物總離子流圖及質譜圖Fig.1 SEM derivative total ion current and mass spectra

表2 呋喃西林代謝物及其內標的質譜條件Table 2 NFZ metabolites and their internal target mass spectrometry conditions

1.3.2 羅氏沼蝦蛋白質的測定

為研究不同處理方式下羅氏沼蝦蛋白質分解對SEM的檢出影響,采用考馬斯亮藍法 (Bradford法) 對羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉進行蛋白質檢測[16,21]。

1.3.3 羅氏沼蝦SEM生成相關性驗證實驗

本實驗于室內養殖缸進行,在整個實驗期間,水位和溶解氧保持恒定。羅氏沼蝦蝦苗從廣州當地養殖場獲得,在前期生長過程中未曾添加NFZ藥物,須足完整,活潑好動,育齡1月左右。實驗前于養殖缸內暫養1周左右以適應環境。正式實驗開始前,對水體和飼料均進行SEM的檢測。

選擇平均個體質量為(10.0±2.0) g,體長(5±1) cm的羅氏沼蝦放入養殖缸中,隨機分組,養殖密度約為30尾/m3。飼料中精氨酸添加量分別為0、10、30、50 g/kg。按每天喂養100 mg/kg的劑量早晚各投喂1次。分別于第0、10、20、30、40天取羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉部位,按1.3.1節檢測羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中的SEM含量。

2 結果與分析

2.1 不同處理方式對羅氏沼蝦SEM檢出量的影響

按1.1節方法制備樣品,按1.3.1節方法確認樣品中的SEM檢出量。檢出情況見表3和圖3。實驗結果 (表3和圖3) 顯示,未處理的羅氏沼蝦原蝦與不同處理方式下的蝦殼和蝦肉中恒有SEM檢出,蝦殼中的SEM檢出量明顯高于蝦肉中的SEM檢出量(P<0.05),且檢出量均大于1.0 μg/kg。在保證相同質量和相同實驗操作條件下,凍干處理的蝦殼和蝦肉中的SEM檢出與未處理原蝦蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量無明顯差異(P>0.05),這說明溫度對羅氏沼蝦SEM檢出量的影響并非是因為水分濃縮而引起的。與未經處理的原蝦對比,隨著烘干溫度的升高,蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量均不斷上升,其中蝦殼70 ℃和100 ℃,100 ℃和130 ℃烘干條件下的SEM檢出量存在顯著性差異(P<0.05),而50 ℃與70 ℃差異不顯著(P>0.05),蝦肉50 ℃與70 ℃, 70 ℃和100 ℃,100 ℃和130 ℃烘干條件下的SEM檢出量存在顯著性差異(P<0.05),而原蝦與50 ℃差異不顯著(P>0.05),這與CAO等[22]結論相似,因此在對水產品進行SEM檢測時應盡可能地將溫度控制在50 ℃以下,以免對實驗結果造成誤差。

表3 不同處理方式下樣品中SEM的檢出量 單位:μg/kg

研究發現,SEM是離子型化合物,在高溫狀態下有一定的熱分解性,熱分解過程是連續進行的,總共包括1個吸熱過程和3個放熱過程。SEM在166～178 ℃開始第一步熱分解,因此隨著加熱溫度達到200 ℃,SEM的分子結構已經不完整[23],在液質檢測過程中未呈現相應峰形,如圖2所示。由圖3可以看

圖2 200 ℃處理下SEM及其內標總離子流圖Fig.2 SEM and internal standard total ion current diagram under 200 ℃ treatment

圖3 不同處理方式下SEM的檢出量Fig.3 The detected amount of SEM in samples under different treatment methods注:不同不寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

出,烘干溫度的高低對羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量有顯著影響,總體表現為隨著烘干溫度的升高,蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量逐漸上升,相比于蝦肉,蝦殼中的SEM檢出量基數更大,因此蝦殼SEM檢出量受溫度影響更大。

2.2 不同處理方式對羅氏沼蝦蛋白質含量的影響

采用Bradford 法對羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中所含蛋白進行定量檢測分析,用系列濃度蛋白繪制蛋白質標準曲線,得到的回歸曲線方程為y=0.053 1x+0.016,R2=0.992 9 (圖4)。研究發現不同處理方式對羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉的蛋白質含量影響不同,在保證相同質量和相同實驗操作條件下,凍干處理的蝦殼和蝦肉中的蛋白質含量與未處理原蝦蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量無明顯差異 (P>0.05),與未經處理的原蝦對比,隨著加工溫度的升高,蝦殼和蝦肉中的蛋白含量逐漸下降,不同加工溫度下的蛋白含量存在顯著性差異 (P<0.05),具體結果見表4和圖5。將同一處理方式的羅氏沼蝦不同部位中蛋白質含量與其SEM檢出量比較,發現蛋白質含量最高的蝦殼和蝦肉中SEM檢出量最低,而蛋白質含量相對較低的蝦殼和蝦肉中SEM檢出量卻相對較高。以SEM檢出量和蛋白質含量繪制曲線,如圖5所示,曲線相關系數為負值(P<0.05),說明蛋白質含量與SEM檢出濃度呈相反趨勢,這表明羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中SEM的生成與其蛋白質的含量也可能相關,樣品中蛋白質含量越高,其SEM檢出量越低。

圖4 蛋白質標準曲線Fig.4 Protein standard curve

A-羅氏沼蝦蝦殼,B-羅氏沼蝦蝦肉圖5 羅氏沼蝦不同組織中SEM檢出量與蛋白質含量相關性分析Fig.5 Correlation analysis of semicarbazide concentration and protein content in different tissues of M.rosenbergii

表4不同處理方式下樣品中蛋白含量Table 4 Protein content in samples under different treatments

2.3 精氨酸對羅氏沼蝦中SEM檢出量的影響

通過上述實驗證明,羅氏沼蝦SEM的檢出與溫度變化顯著相關,結合相關研究,溫度的改變引起的蛋白質變化是影響SEM檢出變化的主要因素。氨基酸是蛋白質的基本構成單位,蛋白質通過各種酶的聯合作用分解成氨基酸。另有研究證明,SEM的生成與氨基酸組成有關,SEM是由含氮物質 (如精氨酸、組氨酸、瓜氨酸和肌酐) 與酰胺或尿素反應形成[24-25]。對上述研究與結論,本實驗精氨酸對羅氏沼蝦內源SEM生成的影響見圖6。如圖6所示,隨著養殖時間的延長,羅氏沼蝦蝦殼內的SEM檢出量呈現先上升后下降的趨勢,而蝦肉中的SEM檢出量無明顯變化趨勢。這可能是由于羅氏沼蝦初期攝入優質蛋白飼料后迅速進入成長期,蝦殼中的SEM檢出量隨著蝦體的生長也隨之升高,隨著蝦體的生長進入頻繁的蛻殼期,蝦體不斷蛻殼致使蝦殼中的SEM難以完整富集,SEM檢出量隨之下降。羅氏沼蝦蝦肉在整個養殖期間恒有SEM檢出,并且隨著養殖時間的延長,蝦肉中的SEM檢出量無顯著差異 (P>0.05)。由圖6可以看出,隨著飼料中攝入精氨酸的含量增加,羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中SEM的檢出量也隨之增加,不同含量精氨酸飼料喂養的羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中SEM檢出量存在顯著性差異 (P<0.05)。將不同生長時期的羅氏沼蝦不同組織的SEM檢出量與攝入的精氨酸含量做相關性分析,以SEM檢出量和精氨酸含量繪制曲線,結果見圖7。由圖7可以看出,精氨酸含量與SEM檢出量呈正相關,這表明羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中SEM的生成與其攝入的精氨酸含量相關,精氨酸能促進羅氏沼蝦體內SEM的生成,樣品中精氨酸含量越高,其SEM檢出量越高。

圖6 精氨酸對羅氏沼蝦內源SEM檢出量的影響Fig.6 Effect of arginine on endogenous SEM detection of Macrobrachium rosenbergii注:大寫不同字母表示不同含量的精氨酸對羅氏沼蝦內源SEM檢出差異顯著(P<0.05);小寫不同字母表示養殖時間對羅氏沼蝦內源SEM檢出差異顯著(P<0.05)。

A-羅氏沼蝦蝦殼,B-羅氏沼蝦蝦肉圖7 不同生長期羅氏沼蝦不同組織中SEM檢出量與精氨酸含量的相關性分析Fig.7 Correlation analysis between SEM detection amount and arginine content in different tissues of M.rosenbergii in different growth stages

3 結論與討論

本實驗通過對不同處理方式下的羅氏沼蝦的蝦殼和蝦肉中的SEM進行檢測,得出隨著烘干溫度的升高,羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中的蛋白質含量逐漸降低,而蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量卻隨之升高,這說明烘干溫度對羅氏沼蝦內源性SEM的生成有促進作用,在對羅氏沼蝦等甲殼類水產品進行NFZ的檢測時,應盡可能避免蝦殼等甲殼物質混入其中,同時避免檢測溫度高于50 ℃。通過對羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中氨基酸的分析,本實驗通過室內人工喂養精氨酸混合飼料的方式探索羅氏沼蝦內源性SEM生成的可能影響因素。實驗結果發現,隨著養殖時間的延長,羅氏沼蝦蝦殼內的SEM呈現先升高后降低的趨勢,蝦肉中的SEM檢出量無明顯變化趨勢。攝入不同含量精氨酸的羅氏沼蝦,蝦殼和蝦肉SEM檢出量分別存在顯著性差異 (P<0.05),這說明精氨酸能夠促進羅氏沼蝦內源性SEM的生成。